金钗石斛生物总碱对脂多糖激活星形胶质细胞产生炎症因子的影响

2011-06-09张俊青龚其海石京山

中国药理学通报 2011年6期

张俊青，吴芹，龚其海，张锋，金凤，聂晶，石京山

(1.遵义医学院药理学教研室，贵州基础药理重点实验室，贵州遵义 563000;2.济宁市精神病防治院，山东济宁 272051)

炎症反应在阿尔采末病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、脑缺血和中风(stroke)等中枢神经系统退行变疾病的发病过程中扮演着重要的角色，甚至成为很多原发病发展的主要原因［1］。

星形胶质细胞是中枢神经系统的免疫吞噬细胞，在致炎因素作用下被激活成反应性星形胶质细胞。激活的星形胶质细胞具有吞噬功能，并增加分泌细胞因子如白介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及 NO 等，这些物质对神经细胞有毒性作用，使神经细胞凋亡并坏死［2－3］。

脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌内毒素的主要成分，研究表明LPS可以诱导星形胶质细胞激活，通过细胞因子TNF-α、IL-6的释放引起炎性反应，从而导致各种病理状态。

石斛(Dendorbium nobile)在我国传统医学中名贵中药材。有研究表明，石斛提取物能明显抑制LPS 诱导的星形胶质细胞分泌 IL-6、TNF-α、NO［4］。本实验室前期研究发现金钗石斛生物总碱对原代培养的大鼠神经元具有保护作用，并发现其在神经药理活性方面具有积极作用［5］。

本课题观察了金钗石斛生物总碱对LPS诱导的大鼠大脑皮层星形胶质细胞的激活，及其产生和释放TNF-α、IL-6的影响及其可能的机制，利用MTS法检测培养的细胞生存率;ELISA法检测TNF-α炎性因子蛋白的表达，通过实时荧光定量PCR(real time RT-PCR)测定TNF-α、IL-6 mRNA水平，进而为金钗石斛的进一步研究提供基础药理学依据。

1 材料

1.1实验动物清洁级(SPF级)Sprague-Dawley(SD)大鼠种鼠25只，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心(合格证书号渝SCXK20070005)。

1.2主要试剂和药品金钗石斛生物总碱由遵义医学院基础药理贵州省重点实验室提取;脂多糖(批号78K4044)购于Sigma(上海)贸易有限公司;TNF-α ELISA试剂盒，上海西塘生物科技有限公司;β-actin、TNF-α、IL-6 引物、RNA 逆转录盒、荧光混合物购于美国ABI公司产品。

1.3主要仪器和设备SL SHELNB CO2孵箱为美国产品;IDGCJ-0.5超净工作台由上海先锋电器厂制造iCycler荧光定量PCR仪为BIO-RAD美国产品;逆转录仪由德国Eppendorff制造;通用全自动酶标仪由美国Bio-Rad公司制造。

2 方法和观察指标

2.1大鼠大脑皮质星形胶质的培养取新生3 d的SD大鼠，体积分数为70%乙醇消毒3次，无菌条件下取出大脑，将大脑皮质放入D-Hank's液中，剪成1 mm3左右的小块，200目筛网过滤。用机械吹打法逐步移取上清液中的单细胞，4℃、1500 r·min－1、10 min，弃上清液取沉淀，用含 20% 胎牛血清，100 kU·L－1青霉素和链霉素的DMEM制成悬液后，调节细胞密度为1×105·L－1，接种于L-多聚赖氨酸包被12 h的25 cm2培养瓶中，移入5%CO2培养箱37℃培养。0.5 h差速贴壁两次后，将培养液移入新培养瓶去除成纤维细胞，静置培养，3 d后换液。培养9～14 d待细胞融合后传代。

2.2实验分组金钗石斛生物总碱实验随机分为5组:正常组，模型组，低、中、高剂量组(0.025、0.25和2.5 mg·L－1)。准确称取脂多糖(LPS)2 mg，溶于2 ml生理盐水中，配成1 g·L－1的母液，－20℃冰箱保存。临用时用无胎牛血清的DMEM/F12培养液稀释成终浓度为10 μg·L－1。取培养2～3代生长状态良好的细胞加入脂多糖作用细胞6 h，正常组加入等量的培养基。再分别加入不同剂量的石斛生物总碱作用24 h，取上清液检测指标。

2.3MTS检测细胞的存活率用 MTS(即 MTS Reagent Powder和PMS的混合溶液)检测细胞生存率。每孔加入100 μl含5%胎牛血清的培养液进行同步化培养24 h，弃培养液，每孔加入90 μl含不同浓度药物的培养液培养24 h，最后每孔加入10 μl的MTS溶液，37℃ 95%空气+5%CO2孵箱培养4 h。酶标仪测定各孔的吸光度值(absorbance，A)。

2.4ELISA法检测TNF-α蛋白的含量星形胶质细胞传2～3代后进行分组，药物处理后，收集细胞培养上清液，1 500 r·min－1，4℃，离心 10 min，分装，－80℃冻存。取上清采用TNF-α检测试剂盒说明书所示的操作方法，用酶标仪测定样品在450 nm的吸光度值(A450值)。

2.5Real time RT-PCR定量分析检测TNF-α、IL-6 mRNA的含量引物制备:分别参照GenBank基因库中关于大鼠TNF-α、IL-6和β-actin的mRNA序列设计引物。

2.6统计学处理结果以±s表示，应用SPSS13.0统计软件分析，组间比较用单因素方差(one-way ANOVA)结合LSD检验。

3 结果

3.1MTS检测金钗石斛生物总碱对LPS诱导大鼠皮质星形胶质细胞增生的影响模型组激活的细胞增殖率明显高于正常组，石斛生物总碱各剂量组与模型组比较明显降低细胞增殖率(Tab 1)。

3.2金钗石斛生物总碱对LPS诱导的TNF-α蛋白水平的影响模型组激活的细胞TNF-α蛋白表达上升，明显高于正常组，石斛生物总碱各剂量组与模型组比较均下调TNF-α蛋白的表达(Tab 2)。

Tab 1 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on the astrocyte proliferation induced by LPS(±s，n=8)

#P ＜0.05 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

＊＊

Tab 2 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on the level of TNF-α protein induced by LPS(±s，n=5)

#P＜0.05 vs normal group;*P＜0.05 vs model group

Group TNF-α/PG/ml Normal 65.312 ±10.308 Model 98.848 ±10.792#Dendrobium nobile alkaloids(0.025 mg·L －1)81.681 ±9.255*Dendrobium nobile alkaloids(0.25 mg·L －1)80.084 ±8.587*Dendrobium nobile alkaloids(2.5 mg·L －1)75.293 ±10.703*

3.3金钗石斛生物总碱对LPS诱导的星形胶质细胞TNF-α，IL-6 mRNA表达的影响模型组激活的星形胶质细胞TNF-α，IL-6 mRNA表达上升，明显高于正常组，石斛生物总碱各剂量组与模型组比较其TNF-α，IL-6 mRNA的表达明显降低(Tab 3)。

Tab 3 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on LPS-induced mRNA expressions of TNF-α and IL-6(±s，n=5)

#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs model group

Group TNF-αIL-6 Normal 5.81 ±6.25 23.32 ±30.64 Model 100.00 ±12.9# 100.00 ±18.72#Dendrobium nobile alkaloids 0.025 mg·L －1 43.79 ±6.25* 32.92 ±15.73*0.25 mg·L －1 9.01 ±3.61* 32.48 ±2.75*2.5 mg·L －1 6.35 ±1.38* 26.94 ±8.28*

4 讨论

在中枢神经系统炎症环境下，星形胶质细胞和小胶质细胞共同承担着免疫细胞的角色，尤其是星形胶质细胞，在很多脑部疾病中通过产生和释放有害的促炎症反应调节因子如NO、IL-6及TNF-α等来启动和促进炎症反应进展［6］。目前神经变性疾病的病因及发病机制尚未阐明，缺乏针对性的治疗药物，相应的治疗效果不确切，并且许多药物长期使用后造成的毒副作用限制了其临床应用。因此，寻找有效防治神经变性疾病的药物无疑将为提高人类的生活质量作出巨大贡献，利用中草药有效成分防治神经变性疾病是目前国内外新药研发的重要方向。

本实验在体外培养的星形胶质细胞中加入LPS，MTS值明显增加，与隋海娟［7］研究发现 LPS可增加星形胶质细胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α。炎症因子TNF-α、IL-6分泌量增加，说明星形胶质细胞被激活。LPS诱导的星形胶质细胞的激活包括形态的改变，数量的增加。星形胶质细胞的数目增加起因于星形胶质细胞前体细胞的增殖和(或)分化。炎症介质比如TNF-α能够诱导星形胶质细胞分裂。增生活化的星形胶质细胞对神经元的有益或者有害作用一直存在争论，在神经变性疾病中，发现增生活化的星形胶质细胞可分泌神经营养因子，如碱性成纤维生长因子、脑源性生长因子、睫状神经营养因子以及胶质细胞源性生长因子等，说明星形胶质细胞具有神经保护及修复作用。本实验研究发现LPS作用星形胶质细胞，数量明显增加，活化的星形胶质细胞对神经元的作用是有益的。

炎症反应在AD的发病和进展中起着非常重要的作用［8］。脂多糖(LPS)直接作用于星形胶质细胞可引起TNF-α和活性氧族的过量生成，产生炎症和氧化应激双重损伤［9］。研究发现，TNF-α能够诱导星形胶质细胞激活，然后迅速地合成大量的TNF-α和IL-6等炎症细胞因子，导致免疫炎症损伤，Munoz-Fernandez等［10］研究发现激活的星形胶质细胞能够产生一氧化氮细胞毒性物质而导致组织的损伤。抗炎和抗氧化是金钗石斛主要的药理特性，本研究发现金钗石斛生物总碱能明显地减少IL-6、TNF-α的mRNA表达，提示石斛总碱可通过抑制炎症通路对神经细胞发挥保护作用。

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