关白附总碱盐抗大鼠房颤作用

汤依群 尹月淼 黄 潞 汪旻晖 于雪莉 徐 静

（中国药科大学临床药学教研室，江苏 南京 210009）

心房颤动（atrial fibrillation，AF）是临床上最为常见的快速性心律失常，可引起血流动力学发生改变和脑栓塞等严重并发症，AF已成为心律失常领域的研究热点。

关白附为中药毛莨科黄花乌头Aconitum coreanum（Levl,） Rapaics的块根，主治心痛血痹，具有祛风，燥湿，化痰，止痛作用[1,2]，化学成分主要有关附庚素 （Guanfu base G，GFG），关附甲素 （Guanfu base A，GFA），关附壬素 （Guanfu base I，GFI） 等，其中关附甲素为首次发现的全新结构类型的安全、有效的广谱抗心律失常一类新药，已获得国家新药证书和生产批文。我们以关白附总生物碱提取物为有效部位，控制总生物碱含量达50%以上，在国家新药创制重大专项基金支持下，进行抗房颤口服制剂的开发。

本实验选用尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙混合液制备大鼠心房颤动模型[3]，结合western-blot实验，观察关白附总碱盐抗房颤作用。

1 材料与方法

受试药：关白附总碱盐，编号2010-0505，（GFI 2.7%，GFA 82.9%），中国药科大学刘静涵教授提供，乙酰胆碱，决奈达隆，纯品，Sigma；其余试剂市售，分析纯。

1.1 实验动物和分组

雄性SD大鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物中心，合格证号SCXK（沪）2008-0016。随机分组，实验设正常，造模，治疗组。 正常组大鼠10只，iv 生理盐水7d。其余大鼠10%水合氯醛麻醉，尾静脉注射ACh-CaCl2混合液（0.1gCaCl2+6.6μgACh/10mLH2O，0.1mL/100g），每天一次，第四天，随机分成①模型组、②关白附总碱盐口服低剂量（5mg/kg）、③中剂量（15mg/kg）、④高剂量（45mg/kg）和决奈达隆组（1mg/kg，ip）。药物治疗3d。

1.2 AF 持续时间测定与ECG 参数的测量

大鼠麻醉，在ECGⅡ监测下静脉注射Ach-CaCl2诱发房颤，对照组大鼠麻醉后注射生理盐水，以出现房颤f波及P波消失为典型房颤心电图，以恢复窦性心律及f波消失，P波出现为房颤终止。计算大鼠造模后房颤持续时间。于实验第1天，第4天和第7天造模完成30min后记录II导联心电图，计算QTc。

1.3 大鼠心房肌有效不应期测定

如文献[4]描述，每组取8只大鼠在实验第8天进行ERP测定。

1.4 Western-blot 法测定大鼠心房组织缝隙连接蛋白Cx40的表达

造模结束后，取大鼠心房，加入RIPA裂解液（Biouniquer），剪碎匀浆离心后提取总蛋白。Bradford法定量。样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜，封闭，4 ℃孵育一抗过夜 （兔抗Cx40一抗，美国Santa Cruz 公司；鼠抗GAPDH一抗，Bioworld公司） 。

TBST洗膜，二抗室温摇床孵育 （HRP标记山羊抗兔二抗Biouniquer公司；HRP标记山羊抗小鼠二抗，北京原平皓生物）。HRP-ECL法显色（ECL化学发光试剂盒，Biouniquer 公司），X线胶片感光，扫描，Quantity One 4.6.2 凝胶图像分析软件分析，以目的蛋白与GAPDH灰度值的比值计算目的蛋白的表达水平，重复三次。

1.5 统计学处理

采用SPSS 12.0统计分析软件，数据以均数±标准差（±s）表示，t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表2 关白附 (关1)对大鼠QTc的影响（ ±s，n=6）

表2 关白附 (关1)对大鼠QTc的影响（ ±s，n=6）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs给药前后；##P＜0.01 vs 造模第一天。

QTc D1前 D1后 D4前 D4后 D7前 D7后model 0.178±0.004 0.172±0.004 0.172±0.004 0.17±0.004*## 0.161±0.006## 0.157±0.005*##关1低 0.168±0.007 0.165±0.007 0.192±0.009## 0.187±0.009**## 0.198±0.009## 0.186±0.008**##关1中 0.183±0.009 0.174±0.007 0.196±0.006## 0.189±0.008*## 0.204±0.007## 0.184±0.01*##关1高 0.168±0.003 0.168±0.011 0.193±0.01# 0.178±0.006* 0.211±0.019# 0.193±0.005#决奈 0.172±0.006 0.171±0.004 0.198±0.006## 0.193±0.006## 0.215±0.007## 0.204±0.006*##

2 实验结果

2.1 大鼠尾静脉注射药液（CaCl210 mg/mL，ACh 66μg/mL），诱导出典型大鼠房颤心电图：P波消失，f波出现，R-R间期不等，可自行恢复窦性心率。连续造模7d，大鼠房颤持续时间逐渐延长，心房ERP缩短。关白治疗组，房颤持续时间缩短，ERP延长至正常水平，见图1、图2和表1。

图1 正常和房颤大鼠II导联心电图

表1 关白附2010至0505（关白1）对房颤大鼠左心房ERP（ms）的影响（±s，n=6）

表1 关白附2010至0505（关白1）对房颤大鼠左心房ERP（ms）的影响（±s，n=6）

*P＜0.05，**P＜0.01，与正常组比较；# P＜0.05，##P＜0.01，与模型组比较

组别 正常 模型 关白1低 关白1中 关白1高 决奈ERP 77.4±5.3 65.3±3.6**78.8±2.7##80.8±2.3##81±5.3##76.3±2.9##

图2 关白附总碱盐对大鼠房颤时间的影响（±s，n=6）

2.2 关白附对房颤大鼠复极参数QTc和左心房ERP的影响

实验结果见表2。大鼠造模7d，左心房ERP缩短，提示电重构形成，关白附治疗后，心房ERP有效延长，心室复极参数回复到正常水平。

2.3 房颤大鼠心房组织Cx40蛋白表达的变化

与正常组相比，模型大鼠心房肌中Cx40含量下降（P＜0.01），关白附治疗组，能有效保护Cx40蛋白表达，维持心房电信号同步。Western 原始图和表达结果如图3所示。

图3 关白附保护心房Cx40蛋白表达

3 讨 论

AF疾病发生发展中存在“房颤致房颤”（AF begets AF）现象[5]，即房颤持续慢性存在，能够引起心房结构重构和电重构，形成房颤基质。实验研究显示，心房持续性颤动，可引起心房体积增大、心房纤维化等结构改变。电重构主要表现为心房有效不应期（atrial effective refractory period，AERP）缩短和不应期频率适应性降低。心房发生电重构后，可促使AF发作频率增多、发作时间延长，甚至不能自行转复。目前认为，异位兴奋灶只是AF发生的触发机制，而AF得以维持，有赖于心房电和结构重构的基质即房颤基质[6]。AF电重构成为人们研究的热点，本实验以左心房ERP值作为电重构功能性指标，观察关白附抑制房颤引起的电重构作用。

心电图参数中，QT间期反映心室肌复极过程。QT间期受心率影响较大，心率加快，QT间期缩短。校正QT间期，即QTc，可消除心率引起的QT间期变化，被认为是衡量心室复极过程较可靠指标。本实验结果显示，持续房颤刺激，模型组大鼠心室复极加快，QTc缩短。提示房颤模型大鼠，心室电生理特性适应性改变。QT过度缩短，即SQT综合症，可诱发室性心律失常，是危险的心律失常发生征兆。关白附治疗后，可有效延长模型大鼠QTc，恢复心室电生理特性。

细胞间缝隙连接（gap junction，GJ）作为细胞间的一种特殊通道介导着细胞间电和化学信号的传递，在维持电和机械偶联，以及确保心肌协调收缩方面起着重要作用[7]。缝隙连接蛋白40（connexin40，Cx40）主要分布在心房肌，是心房电激动传导的关键蛋白，Cx40表达和功能的改变，有助于维持局部微折返，导致持续性AF[7]。实验结果提示，关白附可有效提高房颤引起的Cx40表达下调，回复心房电传导功能。

决奈达隆2009年FDA批准上市，用于预防心房颤动或恢复窦性心率，预防室性心动过速和心室颤动[8,9]。 本实验结果显示，关白附治疗房颤作用与决奈达隆接近，本课题组药动学研究显示，关白附口服片生物利用度大于80%（数据待发表），而决奈口服生物利用度仅15%，提示关白附口服制剂在抗房颤作用上具有广阔的应用前景，值得进一步深入研究。

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