植酸酶耐热性评价方法的研究

马俊孝 卢彦梅 刘 伟 张赞剑 史衍鲁

植酸酶是一种能水解植酸的酶类，在提高饲料中磷的利用率、减少粪便中有机磷的排放以及降低饲料成本方面的效果已被广泛证实[1－2]。与所有的酶制剂一样，植酸酶对温度、酸碱、水分及贮存等环境因素很敏感，尤其是温度、水分对酶活性有很大的影响。畜禽饲料生产过程中的制粒、膨化、挤压调质等工序，温度一般在70～95℃，会严重破坏酶的活性，从而限制酶使用。采用的微丸包被技术生产植酸酶是解决这个问题的一个现实、有效的方法。

市场上已有几种微丸型的耐高温植酸酶产品，但这种耐高温植酸酶对饲料制粒过程的耐受性能仍然是最受关注的焦点。如何比较不同的耐高温植酸酶从而选择合适的产品是困扰使用者的难题。因此，有必要建立一种快速、简易的方法，有效评价饲料加工过程中植酸酶活性的损失情况具有重要的应用价值。本文比较了几种实验室条件下评价植酸酶耐热性的方法，并结合饲料制粒试验，提出了一种简单、快速并接近饲料加工过程中酶活损失情况的植酸酶耐热性评价方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

耐高温植酸酶为收集自国内市场上常见的几种产品。

1.2 酶活力检测

植酸酶产品的酶活检测参照国家标准GB/T 18634—2009，采用分光光度法测定 [GB/T 18634—2009《饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》]。酶活力定义为：样品在植酸钠浓度为5.0 mmol/l、温度为37℃、pH值为5.0的条件下，每分钟从植酸钠中释放1 μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U/ml（或U/g）表示。

饲料试验样品中植酸酶的酶活按照刘玉庆等[3]所述方法进行检测。

1.3 实验室条件下植酸酶的耐热性评价

水浴法：准确称取0.2000 g样品，用少量缓冲液转移到50 ml容量瓶中，定容，磁力搅拌条件下浸提30 min，取上清液进一步稀释，使稀释液酶活在20～30 U/ml左右，取上述稀释液10 ml置于80℃的水浴中处理5 min、10 min，取出自然冷却，测定处理后溶液中植酸酶活性。

干热法：准确称取0.2000 g样品于200 ml烧杯中，置于80℃电热恒温鼓风干燥箱中热处理10 min，取出自然冷却后，测定热处理前后样品的酶活。

湿热法：准确称取0.2000 g样品放入200 ml烧杯中，置于手提式高压蒸汽消毒器内，盖上盖，用饱和水蒸汽处理2 min或更长时间（蒸汽温度从初始的99℃至结束时的110℃），取出后自然冷却，分别测定处理前后的酶活。用蒸汽处理酶样品时要防止冷凝水滴入烧杯中。

植酸酶的耐热性能以酶活的残存率来表述，以处理后与处理前植酸酶样品的酶活比值(%)来表示，所有数据均为3次测定结果的平均值。

1.4 饲料加工过程对酶活力的影响

耐高温植酸酶的饲料中制粒试验在山东六和集团的不同饲料厂进行，饲料品种为肉中鸡全价配合饲料511，主要饲料加工参数为：调制时间18～30 s，调制温度70～80℃，蒸汽压力0.4～0.5 MPa。试验中除去初始和结尾阶段的料，在生产线上均匀间隔地分别采集混合及成品各12个样本进行测定，取12个测定值的平均值。植酸酶的耐热性能以成品颗粒饲料中酶活与饲料生产前的混合原料中酶活的比值来表示。

2 结果与分析

2.1 不同评价方法对植酸酶耐热性的影响

收集市场上常见的2种耐高温植酸酶产品，根据已报道的文献，用实验室方法及实际饲料制粒试验以考察耐高温植酸酶的酶活力残留情况，结果见表1。结果显示，用不同的评价方法考察同一个植酸酶的耐热性时结果相差非常大，水浴法评价条件下酶活损失最多，而干热条件下酶的损失很少，湿热法的结果介于水浴法和干热法之间。几种实验室评价方法中，湿热法与实际饲料制粒试验结果最为接近。

表1 不同评价方法下植酸酶的耐热性(%)

2.2 湿热法处理时间的优化

表1中，湿热法处理后的酶活损失最接近于实际饲料制粒后的酶活损失情况，可以用湿热法进行实验室条件下植酸酶的耐热性评价。但是，湿热法与实际饲料制粒情况有一定的偏差。因此，对湿热法处理时间作适当延长。选择3种自制的微丸型耐高温植酸酶样品，用湿热处理不同时间，酶的耐热性结果如表2所示。表2中，湿热处理2 min时，3个酶样品的耐热性差别不大，而湿热处理2.5 min时耐热性大幅降低，而且3个样品的耐热性显示了较明显的差异，同时湿热处理2.5 min耐热性评价结果与饲料制粒试验结果更加接近。

表2 湿热法处理不同时间下植酸酶的耐热性表现(%)

然而，在严格条件下进行饲料制粒时，湿热评估法需要再次延长蒸汽处理时间。笔者选择自制的包衣微丸型植酸酶样品F、G、H以及I，用湿热法进行耐热性能的评价，结果如表3所示。

表3 湿热法处理不同时间下植酸酶的耐热性表现(%)

由表3可知，调质温度更高（80℃）、调质时间更长（30 s）、蒸汽压力更大（0.5 MPa）的饲料加工过程，对酶的损伤更大，因此，在所述试验条件下，湿热法3 min的处理结果更接近于饲料加工过程中酶活损失的实际情况。

3 讨论

随着饲料厂越来越多地采用高温短时加工设备，如制粒机、膨化机、深度调质器以及通用熟化制粒机等，饲料中的酶制剂等热敏性组分受到不同程度的破坏。改进热敏性添加剂的生产和使用工艺成为近年来添加剂和饲料工业的一项重要工作，目前，通过提高植酸酶的添加量来弥补因酶活力损失造成的有效值不足，或通过微丸包被技术、基因工程方法改良发酵菌株等手段，一定程度上减轻了饲料加工过程对酶的损害。尽管如此，高温、高湿的饲料加工环境对植酸酶活性仍然有不可避免的影响，有效评价饲料加工过程中植酸酶活性的损失具有重要的应用价值。

目前，实验室条件下评价植酸酶热稳定性常用的方法有干热法、水浴法和湿热法。干热法是将植酸酶置于干燥箱中，然后在一定的温度下处理一定时间，测定植酸酶活性损失的方法。已有的实践表明，由于没有水分因素的影响，大多数植酸酶对干热环境都有较好的耐受性，干热法对酶的耐热性评估结果远比实际饲料制粒结果要高。本试验中干热条件下酶活损失只有5%左右，与其他研究者的报道类似[4－5]。

水浴法是在水浴锅中对植酸酶溶液在一定温度下进行水浴保温来评估酶的耐热性能，所得到的酶活残留率要比实际值低得多。水浴法将酶样品溶解在水溶液中，使酶蛋白完全暴露在较高温度的水环境中，实际是在评价酶蛋白的耐热性能，而不是酶产品的耐热性，因此水浴法对包衣和未包衣植酸酶产品的评估差异较大，与饲料加工过程中酶的实际损失相差甚远。本研究中，样品A是包衣产品，水浴法检测时几乎没有耐热性，然而实际耐热性达67%，而未包衣的样品B却相反（见表1）。

湿热法在干热法基础上加入湿度的因素，使其更接近实际的饲料调质和制粒情况。已报道的湿热法一般需先测定植酸酶样品中水分含量，然后据其水分含量均匀添加纯化水调节待处理样品水分至17%左右（饲料调质时的水分含量一般在16%～18%），再置于恒温箱或水浴中处理一定时间[4,6]。这种评估结果能很好地反映饲料在实际加工过程中酶活损失的情况。但是，在含有一定水分的酶样品（一般水分低于8%）中均匀、准确地添加水分至17%，这个试验操作是一个难题。因此，这种湿热法虽然有效但不是一种简单、快捷的评估手段。文中所述湿热法在蒸汽消毒器中进行湿热处理，操作简单、快捷，而且检测的重复性好，是一种相对有效的实验室植酸酶热稳定性的评价方法。

不同饲料厂由于设备、饲料配方、加工工艺等的差异，饲料制粒过程中的调质温度、调制时间、蒸汽压力、环模孔径等参数有较大的差异。对于某一种植酸酶的耐热性评价，需要针对不同的饲料调质、制粒参数，在湿热蒸汽处理时间上要做出适当调质，使评估方法更接近于特定饲料厂生产的实际。显然，对于比较不同植酸酶之间耐热性能的优劣而言，从笔者在不同饲料厂的试验结果来看，相同条件下湿热蒸汽处理2.5～3 min能得出各个植酸酶的耐热性差别，并且与饲料生产的实际酶活损失情况较为接近。

[1]陈琳,王恬.植酸酶对樱桃谷肉鸡能量、蛋白质和氨基酸利用率及消化酶活性的影响[J].动物营养学报,2009,21(6):938－944.

[2]赵春,朱忠珂,李勤凡,等.不同剂型植酸酶对肉鸡生长性能和钙、磷利用率的影响[J].动物营养学报,2007,19(6):714－718.

[3]刘玉庆,王海,孟庆贺.液态植酸酶后喷涂工艺设备及其产品均匀度测定[J].饲料工业,2007,28(15):12－14.

[4]张常明,左建军,叶慧,等.植酸酶耐热性评价方法的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2008(2):53－55.

[5]苏东海,刘萍,郑亚安,等.包被工艺条件对植酸酶热稳定性的影响[J].生物加工过程,2004,2(3):40－45.

[6]苏俊兵,王永成.耐高温植酸酶的发展现状[J].中国饲料添加剂,2011(5):13－15.