CHE生物饲料发酵过程中活性酵母变化规律的研究

黄 亮 童应凯 任 健 陈仁绍

随着畜牧业的快速发展，抗生素等药品的大量使用，饲料安全、食品安全问题已成为养猪生产者和消费者关注的焦点。发酵饲料能有效地抑制消化道中大肠杆菌、沙门氏菌及一些致病性细菌与病原体的繁殖与生长，对猪疾病的防御有一定的功效，提高生猪产品的食品安全性[2]等。因此，世界各国近年来对猪发酵饲料特别重视，发酵饲料在我国也得到了较好的发展[1]。

CHE饲料的固态发酵过程是一个微生态发酵的过程，固态发酵中多个菌种之间可互相补偿其缺陷，进行协同互生发酵[3]。目前用于固体发酵饲料的微生物，常见的有酵母菌、霉菌、芽孢杆菌和乳酸菌等。

本实验通过对CHE生物饲料发酵过程中，测得的酵母活菌数和还原糖及粗蛋白的含量变化曲线可以更直观地把握菌种的生长与分解基质情况，结合各类菌在发酵过程中的作用，可以人为地提高特定阶段有利微生物数量，使基质的发酵向最有利的方向进行，最终为获得优质高效的微生态生物饲料——CHE打下扎实的基础，为我国生态农业的快速发展，生产无公害绿色肉、禽、蛋、奶打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

天津市祥华生物饲料有限公司CHE饲料样品（每6 h取1次）。

1.1.2 培养基

YEPD培养基：蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%、琼脂2%、pH值6.0。

察氏培养基：NaNO30.3%、KCl 0.05%、K2HPO40.1%、FeSO40.001%、MgSO4·7H2O 0.05%、琼脂 2%，pH值6.7。

1.2 方法

1.2.1 活菌数测定

选用对应的培养基进行微生物培养，具体方法参照杜连祥等[4]微生物试验技术试验，使用涂布平板法进行培养计数，检验程序见图1。

图1 菌落总数检验程序

1.2.2 还原糖含量的测定

使用3,5－二硝基水杨酸比色法对样品中的还原糖含量进行测定[9]。从标准曲线上查出样品的A540值对应的还原糖c（mg/ml），然后按下式计算样品中还原糖的含量。

还原糖含量(%)=c×样品稀释总体积（ml）×10－3/样品质量。

2 结果与分析

2.1 还原糖含量的测定结果及分析

2.1.1 葡萄糖标准曲线(见图2)

图2 葡萄糖含量标准曲线

2.1.2 发酵中还原糖含量的变化(见表1)

从表1可以看出，随着发酵的进行，发酵温度在不断地升高，中间出现微小的波动，可能的原因是翻堆使料温降低。第一次翻堆：从起始温度16～48℃，经历了66 h后，进行了第一次翻堆，翻堆后，发酵温度经历短暂的平稳期后，继续升高；随着发酵的进行，经历84 h后，发酵温度升至55℃，进行第二次翻堆，距离第一次翻堆24 h。6 h后，温度降至50℃，这可能是因为进行了第二次翻堆。之后，发酵温度继续升高；经历108 h后，发酵温度升至58℃，进行第三次翻堆，距离第二次翻堆24 h。6 h后，温度降至55℃之后，料温再次升高；120 h后，发酵温度再次升至58℃，进行第四次翻堆，距离第三次翻堆12 h。之后，料温呈下降的趋势，直至50℃，发酵结束，采用低温烘干箱烘干。CHE饲料固态发酵中，在微生物作用下，能使原料从起始的16℃升至58℃高温。

表1 CHE饲料发酵温度及还原糖含量的监测

CHE饲料发酵中还原糖含量在3.21%～4.88%上下波动，可能是因为在微生物及其产生的各类活性水解酶的作用下，促使高分子化合物淀粉、纤维素等分解为单糖，同时微生物的生长也需要消耗部分所产生的还原糖，所以呈现出此消彼长的趋势，但其能在保证大量的活性益生菌的生长时，保持3.21%的还原糖含量。

当发酵时间达到78 h后，CHE饲料中还原糖的含量呈下降的趋势，并最终稳定在3.32%。这基本保证了发酵结束后CHE饲料成品中含有丰富的营养（速效能源）及活性益生菌生长所需的碳源。

将CHE－饲料发酵过程中温度的变化与还原糖的含量变化曲线(取 1、4、8、12、16 和 23 号样品)进行比较分析，见图3。

从图3可以看出，在发酵前中期（0～114 h）还原糖含量的变化与发酵温度无明显相关，但在114 h，发酵温度达到52℃后，还原糖呈下降的趋势，这可能是因为高温影响了水解酶的活性或酵母菌的生长。

图3 发酵温度与还原糖含量变化曲线比较

2.2 发酵过程中活性菌的生长情况

使用涂布平板法，分别对样品 1、4、8、12、16、20和23号等7个样品进行了活菌数测定，培养温度为28℃，培养时间为2～4 d，测定结果以取样时间为横坐标，酵母菌活菌落数为纵坐标，并将纵坐标的刻度设为对数刻度后，见图4。

图4 酵母活菌数与发酵温度变化曲线分析

从图4可以看出，16～28℃时，随着发酵温度的升高，酵母菌的数量随着温度和时间同步增加，处于菌量积累期；当发酵温度高于28℃后，直至50℃，酵母菌的生长处于下滑期，这可能是因为不耐高温的酵母菌种类慢慢被淘汰；之后，从50～55℃时，酵母菌群得到快速生长，可能的原因是经高温淘汰，剩余的耐高温的优势酵母菌群得到繁殖和生长，在55℃达到最大生长值。随后，发酵温度降至50℃，离开了耐高温的优势酵母菌群的最适生长温度，生长受抑制，生长曲线呈下降趋势，但降幅不大，因为已经积累了相当多数量的菌群。

在菌落计数过程中，通过形态学观察，发现不同阶段的样品在YEPD平板上，均长有常见的酿酒酵母、产朊假丝酵母等。

3 讨论

CHE生物饲料是祥华公司与天津农学院经过几年的合作，于2005年成功研发的。CHE生物饲料是以富含酵母菌、双歧杆菌、芽孢杆菌等有益微生物的益生素为主要原料，添加低聚糖、消化酶、豆粕、玉米蛋白粉、钙、磷等有益活性物，经微生态发酵和低温干燥新工艺，在大量有益微生物作用下，生产出来的集植物蛋白、菌体蛋白与复合酶于一体的生物饲料。

CHE饲料中积累了大量的酵母菌，能为牲畜提供优质的菌体蛋白、维生素、营养素、风味物质、芳香类化合物和代谢化合物等，活性酵母能产生促进细胞分裂的生物活性物质有强化营养和抗病促长的效果[1－2]。

4 结论

①CHE饲料发酵过程中温度会随着时间的增加而升高，最高可达58℃；经过4次翻堆后，可以使发酵的温度控制在58℃以下，并使发酵结束后的料温控制在50℃左右。

②CHE饲料发酵过程中，酵母菌得到了快速的繁殖，在发酵的后期，维持50～55℃的温度，有利于酵母菌的积累。可通过增加发酵后期（50～55℃）的翻堆的次数，使发酵温度控制在50～55℃。一方面，能促进酵母菌活菌数量的快速积累；另一方面，能保证在发酵后期还原糖含量的稳定，满足微生物的生长，及CHE饲料成品中还原糖的含量。

③在采集的CHE饲料样品中，未见霉菌生长（结果未列出）。但CHE饲料发酵过程中还原糖的含量基本维持在3.21%以上，最大值高达4.88%，考虑到霉菌产生的活性酶能水解CHE饲料发酵基质中淀粉、纤维素等高分子化合物，后期优化可在发酵环节中增加霉菌的添加量，以进一步提高饲料的营养价值。

[1]邹志恒,宋琼莉,韦启鹅,等.发酵饲料在养猪生产中的应用与研究进展[J].中国动物保健,2009(3):66－68.

[2]陆文清,胡起源.微生物发酵饲料的生产与应用[J].饲料与畜牧，2008,7:5－9.

[3]张长霞.混菌固态发酵苹果渣生产蛋白饲料的研究[D].天津科技大学,2004.

[4]杜连祥，路福平.微生物学试验技术[M].北京:中国轻工业出版社,2008.

[5]张常书.生态型低成本高效益养殖技术[J].湖南饲料,2000(1):15－18,29－30.

[6]陈敏.发酵稻草主产饲料蛋白优良菌种的筛选[J].饲料研究，1999(9):32－34.