潮阳草鸡胚胎成纤维细胞的体外培养

丁 鸿，邱东萍，游柏寿

（1.揭阳职业技术学院，广东 揭阳 522000；2.彭泽县人民医院，江西 彭泽 332700）

潮阳草鸡是潮汕地区的一种优良鸡种，善觅食，抗病力强，成活率高。属瘦肉型，皮薄肉嫩，味道鲜美，香脆滑润，适宜白切、清炖、盐焗等，是传统的宴客佳肴。本实验以潮阳草鸡胚胎组织为材料，进行体外成纤维细胞的培养，旨在为潮阳草鸡的育种提供细胞学方面的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 潮阳草鸡孵化蛋30枚，9～13日龄，购自汕头市白沙禽畜原种研究所种鸡场。

1.1.2 供试试剂 MEM(含Earle′s盐)培养基购自Gibco，胰蛋白酶（Trypsin 1：250）购自 Amresco，标准胎牛血清（Standard FBS）购自Hyclone，台盼蓝购自Sigma，青霉素、链霉素为国产。全培养基：MEM基础培养基+10%标准胎牛血清+100 IU/mL双抗。

1.2 方 法[1-3]

1.2.1 原代培养 超净工作台内取鸡胚腿部肌肉组织置于小培养皿内，用1×PBS+1%双抗漂洗4～5次，用眼科剪剪成1mm3左右大小，移入培养瓶壁，均匀分散，加入全培养液，倒置培养瓶，置CO2培养箱中（37.5℃，5%CO2），过夜。当组织块贴壁牢固时，翻转培养瓶，不浸润组织块。当细胞长出后，及时更换培养液继续培养。

1.2.2 传代培养 当培养细胞生长至80%～90%汇合时，可进行传代培养。去旧培养液，加入预热至37℃，0.75%的 NaCl溶液，清洗细胞 2～3次，然后加入0.25%的胰酶液，消化10～30 s，倒置显微镜下观察。当发现细胞胞质回缩，细胞间隙增大时，立即加入全培养液，细胞悬液计数，按1∶2或1∶3的比例分瓶，放入温箱中继续培养。

1.2.3 细胞冷冻保存 将处于生长对数期的细胞于24 h前更换新鲜全培养基。常规方法消化细胞，制备成单细胞悬液，血球计数板计数。1 000 r/min离心8min，收集细胞。视细胞数量多少加入冻存液（10%DMSO+90%FBS），调细胞密度到（3～5）×106mL，分装入无菌塑料冻存管中，每支1 mL。将冻存管装入装有异丙醇的冷冻盒，-70℃冰箱过夜。次日提出安瓿，放入液氮罐中保存。

1.2.4 冷冻细胞复苏 从液氮罐中小心取出冻存管，迅速浸没在37～40℃的温水中并快速晃动，使细胞液在1～2min内完全融解。吸出细胞悬液，加入到装有全培养液的培养瓶中。置于37.5℃，5%CO2培养箱中培养。次日更换培养液继续培养。

1.3 细胞形态学性状检测

1.3.1 细胞一般形态学观察 在培养过程中，每天观察细胞生长状态、培养液的pH值改变以及细胞是否污染等。并作好记录，用相差显微镜拍照。

1.3.2 制作细胞生长曲线[4]取生长状态良好细胞，常规方法消化制成细胞悬液，按（1～5）×105个/mL的细胞密度在24孔培养板中接种等量细胞。共设7组，每组3孔，置培养箱中培养。从次日起，即开始计算第一组每孔中的细胞数，取3孔的平均值，如此至第7组结束。用Origin 6.1软件绘成细胞生长曲线图。

1.3.3 细胞冻存前及复苏后细胞存活率 细胞冷冻前和细胞复苏后，采用台盼蓝染色法计算细胞存活率。在Trypan染液中，健康活细胞胞体完整，细胞透明不着色，呈蓝色者均为死细胞。计数1 000个细胞，计算细胞存活率。

2 结果与分析

2.1 胚胎成纤维细胞生长状态

如图1、图2所示，组织块贴附1～2 d后便可见细胞从组织块周围游出生长，典型的成纤维样，随后迅速向外扩散，呈明显的火焰状或放射状走形。2～3 d后便可铺满瓶底，消化传代。消化传代后，细胞30 min便开始部分贴壁。2～3 d便可长满瓶底，此时细胞多发生粘连生长，呈网状分布，细胞界线不甚清晰。长满后继续消化传代，如此直到冷冻保存。

图1 潮阳草鸡原代细胞

图2 潮阳草鸡传代细胞

2.2 细胞生长曲线

常规方法制备细胞悬液，计数，接种24孔培养板，每孔1mL细胞悬液，2.0×105个细胞。连续7 d测得数据如表1所示。

表1 潮阳草鸡细胞培养7 d细胞平均数表

绘制细胞生长曲线图，由图3可以看出，细胞生长曲线呈“S”型，主要经历潜伏生长期、指数生长期、水平静止期3个时期。细胞的群体倍增时间约为24 h。在培养后期，细胞产生接触抑制和密度抑制，生长缓慢或停止生长。

图3 潮阳草鸡细胞生长曲线

2.3 细胞冻存前及复苏后细胞活率

潮阳草鸡胚胎成纤维细胞在冻存前和冻存后的平均存活率分别达到94.8%和90.2%，表明细胞在生长时健康状况良好，培养条件适宜；冻存后解冻则存活率有所下降，表明细胞在冷冻和复苏时可能受到一定的损伤。但在复苏后培养30～60min内便可见有细胞贴壁，4～6 h完全贴壁，与细胞传代后贴壁相比，复苏后细胞贴壁铺展时间明显延长，可达24～36 h，48 h后细胞基本长满瓶底，可传代培养，传代后细胞生长速度和冻存前基本一致。

3 小结与讨论

本实验以潮汕地区地方优质鸡种——潮阳草鸡胚胎为材料，在体外成功培养了成纤维细胞，并进行了传代和冷冻保存，复苏后细胞的存活率仍达到90%以上，为潮阳草鸡的育种在细胞学方面提供了一定的科学依据，也为学院的细胞培养工作搭建了技术平台。

细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌，真菌和病毒等微生物的污染[5-7]，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底，由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染[8]。

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