Nod2基因突变与小肠CD相关性的研究

李 岩，范 红，林菊生，唐晓丹，万 苹

1.云南省第一人民医院消化内科，云南昆明650000;2.华中科技大学同济医学院消化内科肝病研究所

CD(Crohn’s disease)是一种可累及消化道任何部位，以全肠壁炎症、非连续性病变为特点的全身性肉芽肿性炎症。迄今CD的确切病因及发病机制尚不清楚。近来国外很多研究机构如Michigan大学医学院的研究人员在研究CD的遗传倾向时发现了位于16号染色体上Nod2，该基因突变时编码的Nod2蛋白通过激活核因子-κB(NF-κB)来促进肉芽肿性炎症［1］，这在 CD 的发病中起着重要作用。尽管CD最常累及终末回肠及近段结肠，约占65%，但单独累及小肠者仍达20%～30%［2］。国内外对CD患者进行了Nod2的相关研究，该研究数据主要来自于结肠镜确诊的CD患者，而对小肠CD尚无相关报道［1-2］。而现在双气囊小肠镜(DBE)应用实现了小肠CD的诊断和组织取材，使得对小肠CD病因及发病机制的研究成为可能［2］。因此，我们通过对DBE确诊的小肠CD患者取材进行Nod2基因突变与小肠CD相关性的研究。

1 材料与方法

1.1 材料 收集我市各三甲医院2004年4月～2007年3月内镜室标本，通过DBE进行病变部位组织取材，经病理学检查确诊的组织标本小肠CD 24份，结肠CD 44份，溃疡性结肠炎(UC)40份，健康对照(非炎症性肠病者)50份。CD和UC的诊断标准参照2001年中华医学会消化病学分会制定的标准［3］。DNA提取试剂盒购自U-Gene公司。TRIZOL购自BioBasic Inc公司，Canada。mRNA Selective PCR Kit(AMV)Ver1.1购自TaKaRa公司，日本。抗NF-κB P65购自Santa Cruza公司，美国。免疫印迹化学发光试剂(ECL Reageat)购自上海普飞生物技术有限公司。HRP标记二抗、抗β-ac-tin单克隆抗体、AP标记二抗购自Gibco-BRL公司。凝胶成像及分析系统是PC gene公司图像分析软件。PCR仪是Eppendorf(Mastercycler gradient)购自德国。Hybond硝酸纤维素膜购自美国Bio Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 基因测序检测Nod2基因突变与CD的相关性:通过DBE进行病变部位组织取材，DNA提取试剂盒说明书提取基因组 DNA，-20℃保存。针对 NOD2/CARD15基因的12对外显子片断合成15对引物(见表1)［4］。PCR扩增目的片段:反应体系中含DNA模板4 μL、10 μmol/L 上下游引物各 2 μL、2 × 含高保真 DNA聚合酶的预混合PCR反应液25 μL和灭菌去离子水17 μL，共50 μL。反应步骤:94℃预变性5 min，94℃变性45 s，退火45 s，72℃延伸，共35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR反应产物以2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像仪成像，以确定Nod2基因扩增成功。以蒸馏水代替DNA作为阴性对照。PCR产物的纯化和测序:确定目的片段扩增成功后，以DNA凝胶纯化试剂盒纯化PCR产物，应用双脱氧四色荧光法全自动测序仪测序。将患者与健康对照者的NOD2基因序列进行对比，并与基因库数据比较(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。发现突变后，为除外系统误差，PCR重新扩增目的片段，以不同的引物正反两个方向再次测序，证实突变确实存在。

表1 12对外显子所用PCR引物序列及反应条件Tab 1 PCR sequence primers and reaction conditions for 12 pairs exon

1.2.2 RT-PCR检测mRNA的表达:RT-PCR测定根据Genbank中人 NOD2cDNA序列(登录号为NM022162)设计出一对引物，上游引物:5'-GCTGGACTACAACTCTGTGGGTGAC-3'，下游引物:5'-CAGAGTTCTTCTAGCATGACGTTCTTTGC-3'，预计产物长度为495 bp［5］。根据 cDNA 合成试剂盒说明书，取 3 μg RNA样品合成cDNA第一条链。取4 μL cDNA进行NOD2的RT-PCR反应，另取1 μL cDNA进行内参照的RT-PCR反应。PCR的反应条件是95℃预变性3 min，95 ℃变性40 s，58 ℃(Nod2)或60 ℃(内参)退火40 s，72℃ 延伸 45 s，重复 40个循环，72℃ 延伸10min。取8 μL PCR产物电泳，凝胶成像系统拍照。

1.2.3 Western blot检测NF-κB蛋白的表达:提取细胞核蛋白［5］，采用Lowry法准确测定浓度。蛋白质样品上样量每泳道为100 μg，用10%聚丙烯酰胺凝胶分离，并转到Hybond硝酸纤维素膜上(美国Bio Rad公司)。

1.3 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，各组间突变分布的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因测序检测Nod2突变 琼脂糖凝胶电泳结果表明PCR扩增产物与目的片段大小一致，扩增成功。DNA测序结果与国外报道不同，NOD2/CARD15基因在白种人CD中所常见的3个突变位点(R702W、G908R和3020insC)在所有受试者中均未检出。实验结果显示小肠CD组有16例发现Nod2 P268S突变，占66.7%，结肠CD组有14例发现P268S突变，占31.8%，碱基由C变成T，密码子由CCC变成UCC(见图1)。UC组和健康对照组未发现该突变。两CD组突变率显著高于UC组和健康对照组。

图1 Nod2基因纯化后测序图Fig 1 Sequencing diagram of Nod2 gene

2.2 RT-PCR检测各组mRNA表达 小肠CD组Nod2突变标本mRNA表达增加大于结肠CD突变标本，但差异无统计学意义(P＞0.05)，而小肠和结肠CD组无突变的CD患者与UC和健康者表达也无明显差异(P＞0.05)，但Nod2突变的小肠和结肠CD标本的mRNA表达大于任何无突变的标本，差异具有统计学意义(P＜0.05，见图2)。

图2 PCR检测mRNA的表达 M:marker;1:小肠CD;2:结肠CD;3:UC;4:对照Fig 2 Expression of mRNA with PCR M:marker;1:small intestine CD;2:colon CD;3:UC;4:control

2.3 各组NF-κB蛋白表达的差异 与mRNA结果相似，小肠CD组Nod2突变标本NF-κB蛋白表达增加大于结肠 CD突变标本，但差异无统计学意义(P＞0.05)，而无突变的CD患者与UC和健康者表达也无明显差异(P＞0.05)，但Nod2突变的小肠和结肠CD标本的蛋白表达大于任何无突变的标本，差异具有统计学意义(P＜0.05，见图3)。

图3 Western blot检测NF-κB蛋白的表达 1、3:小肠、结肠CD 突变;2、4:无突变 CD;5、6:UC 和对照Fig 3 Expression of NF-κB with Western blot1，3:mutation in small intestine CD and colon CD;2，4 no mutation in CD;5，6:UC and control

3 讨论

小肠疾病种类繁多，但其解剖和生理特点决定了小肠疾病受其起病隐匿、症状特异性不强和病变部位深等众多因素影响，诊疗非常困难。传统的各种检查手段因敏感性和准确性较低，均无法满足临床诊断要求。例如，99mTc核素扫描虽能发现消化道出血的大致病变部位，但在出血量少、间歇出血者中的阳性率甚低;小肠钡剂灌肠对占位性和狭窄性病变有一定诊断能力，但对黏膜、血管性病灶的检出能力不理想，且操作者的个人经验和方法对检查结果有明显影响，其整体阳性率仅在20%左右;创伤性的血管造影术对血管和血供丰富的肿瘤性病变有较高诊断价值，但在黏膜和炎症等疾病中的诊断率非常低，因此，整个小肠疾病的诊断阳性率并不令人满意［6］。于是寻求一种能够直观甚至可以钳取活组织并进行治疗的诊疗器械是现阶段小肠诊疗迫切需要解决的问题。电子内镜对消化道疾病诊断和治疗有着其他检查手段无可比拟的优势，胃肠镜普及运用后，胃和结肠疾病诊断率明显提高，使很多疾病得以及时治疗。2000年，以色列Given公司的Idden等科学家经过20年的努力，发明了胶囊内镜(CE)［7］。从此，一种全新、可靠、操作简易的内镜设备在全世界推广使用，其对小肠全程、实景的观察，使小肠不再是内镜检查的盲区。CE的问世和开展为小肠疾病的诊断提供了一个新的检查手段，无创性方法也易为患者所接受。但CE自身的某些局限性，如胶囊移动的不可控性、无活检功能、肠道内积液对观察的影响、图像分辨率欠佳均影响了它的临床实用性［7］。而2001年日本自治医科大学山本德明成功研制的双气囊电子内镜(DBE)通过经口由上而下和经肛由下而上对小肠进行全面观察，同时可行病理活检和内镜下治疗，具有视野广、图像质量清晰和充气、吸引、活检、电凝、切除等基本功能，它是大多数小肠疾病检查的最理想手段之一［7］。DBE的应用实现了小肠CD的诊断和组织取材，使得对小肠CD病因及发病机制的研究成为可能。

NOD2基因编码NOD2/CARD15蛋白，此蛋白仅在外周血单核细胞中表达，功能为诱导核因子(NF)-κB激活、介导细胞凋亡和影响肠道先天性防御因子，如小肠Paneth细胞防御素的表达［8］。基因发生突变时，NOD2蛋白的功能可能发生改变。多项研究［9］显示R702W、G908R和3020insC与西方白种人CD的发病明显相关。NOD2基因的3020insC发生移码突变，使富含亮氨酸的重复单位(LRR)发生Leu1007氨基酸互换，终止密码子提前，最后的33个氨基酸缺失，NF-κB活性减弱，宿主对肠道细菌产物的先天性免疫反应减弱，特异性继发性免疫过度激活，导致CD发生。其他2个SNP在白种人CD患者中的携带率也显著增高。但对日本、我国香港和浙江地区人群的研究未发现常见于白种人的3个NOD2 SNP［9］。本实验我们首次对小肠CD患者的发病机制进行了研究，显示任何一组患者均未检出3种西方人常见的基因突变位点，提示小肠和结肠CD组织的主要突变位点是P268S。这可能与人种(白和黄)、地域(欧美洲和亚洲)等不同有关。

小肠CD组Nod2突变率和突变标本mRNA和NF-κB的表达 ＞结肠 CD组 ＞UC组 =对照组，说明Nod2与CD的发生有密切关系。它编码的NF-κB蛋白有2个N末端Caspase补充区域(CARD)，1个位于中间的核苷酸结合位点(NBS)以及1个C末端富亮氨酸重复区(LRRS)［10］。基因的突变导致蛋白的LRRS区形成β折叠结构的氨基酸残基的变化，这对蛋白功能的改变起着关键性作用，可能通过识别肽聚糖激发下游信号传导通路，与Rip2和CARD6相作用，调控NF-κB的表达，导致细胞功能的改变，促进 CD的发生［9-10］。

因为病例数较少，小肠CD和结肠CD Nod2突变率的差异是否有统计学意义，尚有待病例的增加。本研究通过病例对照研究对CD易感基因NOD2/CARD15的3个常见突变位点进行检测，并在国内首次对NOD2/CARD15基因的12对外显子进行组织学标本的系统筛查，与龙靖华等血清学的研究结果一致，发现P268S可能是中国人C的易感基因［11］。但由于这种关联研究的局限性，尚不能区分这一位点的突变是改变了基因的功能还是仅仅是一个遗传学标记，此外，P268S突变位点是导致了CD的发生还是加速了病情的进展，上述问题均需进一步探讨。

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