检测犬瘟热病毒的单克隆抗体胶体金试纸条的制备

房 超，张 泉，易海华，吴萍兰，徐 波，吴亚力

（1.徐州出入境检验检疫局，徐州221006；2. 扬州大学兽医学院，扬州225009）

犬瘟热（canine distemper, CD）是由传染性犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）引起的急性、高度接触性传染病，目前已成为危害我国乃至全世界养犬业、皮毛动物养殖业和野生动物保护业最严重的疫病之一[1]。随着经济动物饲养业的集约化、规模化，经济动物疫病尤其是水貂犬瘟热等传染病会形成暴发流行，同时，由于缺乏有效的现场检测手段以及养殖单位对经济动物感染CDV认识的不足，导致动物感染CDV的诊断延误，错过适宜的控制时机，会给毛皮经济动物产业带来巨大损失，严重阻碍该产业的顺利发展。因此，对水貂犬瘟热进行准确、快速的检验对水貂养殖业的健康发展非常重要。

CDV的实验室诊断具有快速、准确和特异性强的优点，可以在疾病早期确诊，提高疾病的治愈率，但目前常用的RT-PCR方法对专业技术要求高，

病毒电镜观察方法又需要昂贵的仪器和专业的技术人员[2]。依赖于单克隆抗体的胶体金免疫层析检测方法操作简便，特异性高，不仅检测时间短，还可进行现场检测，但是目前制备抗CDV单克隆抗体的病原均从犬中分离，尚未有用水貂分离病毒来制备抗CDV单抗的报道[3-5]。因此，用现有单抗来制备检测水貂犬瘟热的胶体金试纸条可能会造成假阳性或假阴性结果。鉴于此，本研究利用单克隆抗体技术制备水貂源CDV单抗，并对金标免疫层析法检测进行摸索，旨在为建立特异、快速、经济的水貂犬瘟热病毒感染检测方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒鉴定 CDV-HB株为扬州大学兽医比较医学中心分离、纯化和保存；参照已发表的CDV H基因序列设计引物，上游引物为5'-GTAG GATCCATGCTCCCCTACCAAGACAA-3'，下游引物为5'-ATGTCGACTATCCCCAGTGACAATA CTAG-3'，使用RT-PCR对分离的CDV-HB毒株进行鉴定。PCR反应参数为：94 ℃预变性 2 min后，94 ℃ 变性 45 s、55 ℃退火 1 min、68 ℃延伸 1 min，进行30个循环，最后以68 ℃延伸10 min，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，EB染色观察。

1.2 病毒与细胞 CDV (Onderstepoort株)，犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）和犬冠状病毒（Canine corona virus, CCV）标准抗原均由军事医学科学院兽医研究所惠赠；6周龄雌性BALB/c小鼠、ICR小鼠购自扬州大学比较医学中心；Vero细胞和骨髓瘤细胞SP2/0由本室保存。

1.3 抗原制备和动物免疫 Vero细胞长成单层后经胰酶消化吹散，按1:2传代，取细胞培养液量1/10的病毒液同步接种CDV-HB；待细胞病变达80%时，将培养液反复冻融3次，3 000×g 离心30 min，10 000×g离心30 min，去除细胞碎片后，在上清中加入PEG 6000至终浓度为9%，加入NaCl至终浓度为0.3 mol/L，4 ℃搅拌2 h后，置4℃过夜；18 000×g离心2 h，弃上清，用5 mL PBS悬浮沉淀，按参考文献[6]免疫小鼠。

1.4 MAb ELISA 检测方法的建立 按方阵滴定法建立间接ELISA法[7]。以 1:100～1:3200稀释的抗原包被ELISA板，确定抗原的最佳稀释度；以1:100～1:12 800倍比稀释 BALB/c 雌性小鼠的阴阳性血清，确定血清的最佳工作浓度；加入1:5000工作浓度的HRP羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)，以TMB为底物，测定OD450值， P/N≥2.1 判为阳性。

1.5 细胞融合与杂交瘤细胞的筛选 取免疫小鼠脾细胞，按照参考文献[8]进行细胞融合与选择性培养，用建立的间接ELISA方法进行筛选，阳性细胞用有限稀释法对其进行克隆与扩大培养。

1.6 腹水的制备和效价及亚类鉴定 按照参考文献[9]制备腹水，并取少量腹水测定效价，按照Sigma 公司的 MAb 亚类鉴定试剂盒操作说明鉴定MAb。

1.7 间接免疫荧光试验 接种CDV-HB的Vero细胞培养板经固定后，用PBS洗涤3次，5 min/次；拍干，然后分别加入1:50稀释的鼠源阳性、阴性血清各 100 μ L ，1:50 稀释的腹水各 100 μ L ，加完样品后做好标记，置37 ℃作用1 h，PBS洗涤3次，每次5 min，拍干；加入1:200稀释的羊抗鼠IgG+IgM荧光二抗，37 ℃作用45 min，同样洗涤后拍干，荧光显微镜观察结果。

1.8 柠檬酸三钠法制备胶体金溶液 参照参考文献[10]将200 mL氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入1%柠檬酸三钠溶液，溶液颜色从浅黄逐渐变黑，然后变红，继续煮沸10 min，搅拌状态下冷却，冷却后微孔滤膜过滤，4 ℃保存备用。

1.9 McAb的纯化和金标记 按参考文献[11,12]纯化抗CDV-HB单克隆抗体，紫外分光光度计检测洗脱液蛋白含量。用0.2 mol/L K2CO3溶液将金溶胶调节到最适pH值8.7，在每毫升胶体金溶液中分别加入 12、9、6、3、1μ g和 0.5 μ g单抗，室温作用5 min；分别加入10%的NaCl溶液50 μ L ，混匀后静置2 h；记录胶体金溶液颜色变化最小的蛋白量，室温静置2 h，此时颜色变化最少的蛋白量即为最小标记蛋白量；在最小蛋白量基础上增加10%，即为标记时所需蛋白的最适量。

1.10 免疫试纸条的制备和初步鉴定 试纸条的制备按参考Millipore公司免疫层析试纸条制作手册（第二版）进行。取蛋白浓度为3.12 mg/mL的CDV-HB单抗，以1.2 μ L /cm的量标记T线，取蛋白浓度为2.42 mg/mL的兔抗鼠IgG高免血清，以1.0μ L /cm的量标记C线；取35μ L /cm标记的免疫金垫，与上述T、C线组装成试纸条。取标准CDV，CPV和CCV抗原，PBS和阴性检测液，用制备的胶体金试纸条进行检测，验证其特异性。

2 结果

2.1 CDV-HB的RT-PCR鉴定 采用H基因的引物对CDV-HB进行了RT-PCR扩增，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳后染色观察，结果显示以CDV-HB的RNA模板可以扩增出大小为904 bp的特异性片段 (图1)。

图1 RT-PCR 扩增到H基因片段Fig.1 The H gene fragments (904 bp)was amplified by RT-PCR

2.1 针对CDV的特异性单 对第三次免疫后血清效价明显升高的小鼠加强免疫，取其脾细胞进行融合。BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后d 14开始检测，挑选间接ELISA检测结果OD450阳性孔与对照孔比值≥2.1，并且阳性孔OD450＞1.0的杂交瘤细胞进行亚克隆，3次亚克隆后获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2E1和7F3。

2.2 单抗特性鉴定

2.2.1 效价测定 采用间接ELISA测定了单抗的细胞上清、腹水效价，结果见表1。

表1 单抗的间接ELISA效价Table 1 The titers of monoclonal antibodies detected by indirect ELISA

2.2.2 亚类鉴定 按照单抗亚类鉴定试剂盒操作说明，对获取的抗CDV-HB单克隆抗体亚类进行鉴定，结果表明单抗2E1的分子亚类为IgM，7F3的分子亚类为IgG1。

2.2.3 间接荧光试验 接种CDV-HB的Vero细胞经固定、洗涤后，分别加入2E1和7F3的单抗腹水、阳性和阴性血清进行反应，然后加入二抗。荧光显微镜观察的结果表明，阳性血清、2E1和7F3腹水均能与感染CDV的Vero细胞结合，而阴性对照则没有特异性荧光出现（图2）。

图2 单抗的间接免疫荧光检测Fig.2 The detection of the MAb by IFA

2.3 试纸条特异性检测 用制备的试纸条分别检测已知的CDV、CPV、CCV标准抗原，并同时以PBS和阴性检测液作对照的结果显示，只有CDV标准抗原呈阳性，其余均为阴性，表明试纸条具有良好的特异性（图3）。

图3 试纸条检测结果Fig.3 Detection results of test trips for CDV, CPV, CCV

3 讨论

我国水貂饲养业发展迅速，已成为畜牧业的重要组成部分，但随着集约化、规模化饲养的发展，传染病在不断暴发流行，发病率居高不下，其中犬瘟热占主导地位，发病率达10%～30%，是当前危害水貂饲养业最主要的传染病。目前，国内对CDV的检测研究相对集中于RT-PCR和核酸探针的制备和应用[13]，由于水貂源犬瘟热的研究相对较少，针对其病原的快速诊断也主要局限于PCR诊断[14]，但核酸检测必须依赖于实验室设备，不能满足现场检测的需求。因此，为保证水貂养殖业的健康发展，研制针对水貂犬瘟热病毒快速准确的检测方法显得尤为迫切。

由于犬源CDV毒株和疫苗株为适应分离细胞（Vero）表面的CD46受体[15]，其H基因发生了变化，氨基酸推导也证实了经Vero细胞适应后H蛋白存在氨基酸替换的现象[16]，因此，现有CDV的分子特征不能代表水貂源CDV的分子特征。本研究对所分离的CDV-HB毒株的H基因进行了序列分析，发现其与CDV Onderstepoort株H基因的同源性仅为81.6% (资料未显示)，更加证实了水貂源CDV与犬源CDV确实存在着较大差异。因此，虽然市面上有不少国产和进口的犬瘟热病毒胶体金检测试纸条，但其对水貂犬瘟热病毒检测的特异性需要进一步验证。

基于这一现状，本研究通过杂交瘤技术获得了2株高效价的抗水貂源CDV的单克隆抗体，对单抗腹水纯化后进行金标记并制成胶体金检测试纸条，经实验室初步检查，该检测试纸条能够很好地将CDV与CPV和CCV有效区分，具备了较好的检测特异性，但检测灵敏度仍需进一步优化。据报道，胶体金试纸条的检测灵敏度能达到ng级或与ELISA相似[10]，提示胶体金试纸条检测技术可以在短时间内完成高灵敏的检测任务，这也为我们今后进一步改善标记手段、优化检测条件指明了研究方向。

此外，本研究在研制胶体金检测CDV试纸条过程中存在需要进一步探讨的问题。在研制的免疫金检测CDV试纸条条件的摸索中，我们以初步纯化的病毒作为待检抗原，此检测原的成分相对于最终需检测的样品（鼻腔、口腔和眼结膜分泌物等）所含杂质要少，以此作为抗原摸索的各种条件，能否很好的反映并适用于临床样品的检测特性需要进一步的验证和摸索。因此，这些可变因素提示我们在胶体金试纸条的整个制作过程当中，必须严格摸索各种参数，优化各反应条件，才能确保检测的灵敏度与特异性的完美统一。

[1]殷震. 动物病毒学[M]. 北京: 科学出版社, 1997.

[2]Saito T B, AlfierI A A, Wosiacki S R, et al. Detection of canine distemper virus by reverse transcriptase polymerase chain reaction in the urine of dogs with clinical signs of distemper encephalitis[J]Res Vet Sci,2006, 80(1): 116-119.

[3]苏建青, 褚秀玲, 杨松涛, 等. 抗犬瘟热病毒荧光标记单抗的制备和初步鉴定[J]. 安徽农业科学, 2009,37(8): 3552-3554.

[4]王吉, 卫礼 , 付瑞, 等. 犬瘟热病毒(CDV)ELISA 检测方法的建立与应用[J]. 中国比较医学杂志, 2009,19(4): 59-62

[5]陈万荣, 付少才, 刘树玲. 抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及初步应用[J]. 中国兽医学报, 2002, 22(5):455-456.

[6]李健强. 传染性牛鼻气管炎病毒克隆抗体的制备及应用[J]. 西北农业大学学报, 1990, 18(2): 33-40.

[7]段舒怡,姜平,力玉峰, 等. O型口蹄疫病毒 VP1蛋白单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定[J]. 中国人兽共患病学报, 2007, 23(3): 31-32.

[8]章谷, 容秉培. 单克隆抗体在医学上的应用[M]. 上海:上海科学技术出版社, 1987

[9]付少才, 陈万荣. 抗犬细小病毒单克隆抗体的制备及初步应用[J].中国兽医杂志, 2001, 37(11): 31-32.

[10]崔尚金, 姜建宏, 周艳君, 等. 猪繁殖与呼吸综合征胶体金抗体检测技术的建立和初步应用[J].中国预防兽医学报, 2005, 27(3): 213-216.

[11]Orvell C, Sheshoradaran H, Norrby E. Preparation and characterization of monoclonal antibodies directed against four structural components of canine distemper virus [J]. J Gen Virol, 1985, 66: 443-456.

[12]李永勤. 以膜为固相载体的免疫胶体金快速试验[J].微生物学免疫学进展, 2003, 31(1): 74-78.

[13]何洪彬, 夏咸柱. 犬瘟热的诊断及其预防免疫的研究进展[J]. 动物医学进展, 2001, 2(1): 12-14.

[14]鞠会艳, 夏咸柱, 高玉伟, 等. 用RT-PCR检测病料中犬瘟热病毒的研究[J]. 吉林农业大学学报, 2006,28(3): 317-320.

[15]Yanagi Y, Takeda M, Ohno S. Measles virus: cellular receptors, tropism and pathogenesis[J]. J Gen Virol,2006, 87(10): 2767-2779.

[16]Bankamp B, Wilson J, Bellini W. J, et al. Identification of naturally occurring amino acid variations that affect the ability of the measles virus C protein to regulate genome replication and transcription[J]. Virology, 2005, 336,120-129.