上海地区猪群中H1N1甲型流感抗体检测

李凯航，葛菲菲，薛 霞，鞠龚讷，周锦萍

(上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103)

2009年3月，一种新型H1N1甲型流感从墨西哥开始流行并迅速传播，至2009年5月19日，世界卫生组织（WHO）官方网站已经公布全球有40个国家和地区共9830例患者感染该流感[1]。从基因的最初来源看，2009年H1N1甲型流感（以下简称新甲流）病毒（Influenza A virus H1N1 subtype in 2009）含有人、禽和猪的流感病毒基因，目前已经成为全球人群中甲型流感病毒优势流行株。该病毒血凝素（haemagglutini，HA）由RNA第4区段编码，是甲型流感病毒主要抗原基因之一。据报道，新甲流病毒的HA基因与我国流行的猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）HA基因同源性仅为76%～77%，重要抗原位点50%以上发生了变化[3]，因此，可以运用血凝抑制实验（hemagglutination inhibition，HI）进行新甲流病毒抗体检测。同时，鉴于两者之间的可能存在的交叉反应，采用商品化ELISA试剂盒平行检测猪流感病毒抗体。

目前，国内对于新甲流病毒在人群中流行后是否会对猪群造成感染，猪群中的该病的感染现状、流行规律以及抗体水平等方面的相关报道较少。本文通过对上海地区猪群进行新甲流抗体检测，探讨不同饲养模式疫病变化规律，以期为新甲流病毒在猪群中的流行情况研究提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 猪血清样品 2007～2010年共采集猪血清410份，来自上海市9个区县41个养殖场户，-30 ℃冻存备用。

1.1.2 新甲流感病毒血凝抑制试验用甲醛灭活抗原 由上海市疾病预防控制中心惠赠，为新甲流病毒特异性抗原；H1N1亚型猪流感ELISA试剂盒购自美国IDEXX公司，批号：09332-BF471；sunrise酶标仪为TECAN公司产品。

1.1.3 1%鸡红细胞悬液 无菌采集3只公鸡血液，与等体积阿氏液混匀，用0.01mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次，注意弃去白细胞层，每次均以1000×g离心10min，按1%体积分数制备红细胞悬液，4℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 非特异性因子祛除 采用鸡红细胞泥吸附法，在血清样品中加入终浓度为20%的鸡红细胞泥，混匀，4 ℃静置过夜后，1000×g离心，取上清进行检测。

1.2.2 血凝（HA）试验（微量法） 在96孔V型微量反应板1～12孔分别加入25 μL PBS。吸取25μL抗原加入第1孔，混匀，然后将第1孔倍比稀释至第11孔，从第11吸取25μL弃去。每孔加入25 μLPBS，再分别加入25 μL 制备的1%鸡红细胞悬液，震荡混匀，室温（20 ℃～25 ℃）静置40 min后观察结果。结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌，完全血凝的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位。

1.2.3 血凝抑制（HI）试验（微量法） 根据1.2.2结果配置4单位的抗原。以完全血凝的抗原最高稀释倍数为终点，终点稀释倍数除以4即为含4单位的抗原稀释倍数。在96孔V型微量反应板的1～11孔加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS。将第1孔倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25 μL弃去。1～11孔分别加入4单位抗原25μL，室温静置30 min。 每孔加入25 μL 1%鸡红细胞悬液，混匀，静置40 min。 结果判定：以完全抑制4单位抗原的血清最高稀释倍数为HI效价，HI效价≥5判为阳性。

1.3 酶联免疫吸附试验 使用前，将浓缩的洗涤液恢复至室温，摇动混匀，使析出的盐类完全溶解。浓缩洗涤液用去离子水按1:10稀释，样品用样品稀释液进行40倍稀释。取出SIV抗原包被板，记录样品位置。阴阳对照各加2孔，每孔100 μL，对照无需稀释。加100 μL稀释好的样品至相应的孔，室温（20 ℃～25 ℃）孵育30 min。 PBST洗板5次，甩干，每孔加入100μL酶标抗猪抗体，室温孵育30 min。 PBST洗板5次，甩干，每孔加入100 μL底物溶液，室温孵育15 min。最后，每孔加入100 μL终止液，终止反应。在650 nm测量和记录样品和对照的吸光值。 结果判定：SIV抗体存在与否，通过计算样品对阳性的S/P值来决定：如S/P＜0.4，判为血清SIV-H1N1抗体阴性；如S/P≥0.4，判为血清SIV-H1N1抗体阳性。

2 结果与讨论

2.1 按5个时间点（2007年11月、2008年11月、2009年5月、2009年11月、2010年5月）依次将新甲流和猪流感检测数据划分为5组。检测结果显示，2007年11月的养殖场户猪血清中未检出新甲流病毒抗体； 2008年11月和次年5月的样品中存在6.7%～13.3%的新甲流病毒抗体水平。2009年新甲流病毒流行后，猪血清样品中检出的病毒抗体水平持续上升，2009年11月为23.3%，2010年5月达到46.7%。同时检测H1N1猪流感病毒抗体，计算5个小组内的猪流感病毒抗体（S/P值）和新甲流病毒抗体（HI）间的相关系数，介于-0.31～0.325，具体数据和趋势变化见表1和图1。

不同饲养模式的养殖场中，新甲流HI抗体水平变化明显。2007年11月，所有养殖场户猪群中均未检测到HI抗体，但至2010年5月，散养肉猪户猪群HI抗体升至30%，商品肉猪场升至50%，种猪场升至66.7%（见表2），上升幅度为：种猪场＞商品肉猪场＞散养肉猪户（见图2）。

2.2 新甲流病毒基因来源于北美古典型猪流感病毒、北美禽源流感病毒、欧亚猪流感病毒和人季节性流感病毒，其中决定病毒血凝性的HA基因来源于北美古典型猪流感病毒，与亚洲猪源甲型流感病毒同源性较远[3]。Brown等[2]研究表明，甲型流感病毒HA基因氨基酸序列中的21个氨基酸为其重要抗原表位。谢佳新等[3]将这21个抗原表位与猪源甲型流感病毒相比较，发现新甲流病毒HA基因抗原表位与猪源病毒抗原表位有12处不同。正是基于以上的抗原变异基础，本文所用血凝抑制试验抗原能够将新甲流抗体与我国流行的同亚型猪流感病毒抗体加以区分。结果显示，两种疫病抗体的相关性很低，从侧面证明了所用抗原与同亚型猪流感无交叉性或交叉性很低。

表1 新甲流和猪流感抗体水平及相关系数表Table 1 Correlation coefficient of the antibody against new type A In fl uenza virus and Swine in fl uenza virus

图1 新甲流和猪流感抗体水平变化趋势图Fig.1 Variation trend of the antibody elvel against new type A Influenza virus H1N1 subtype and Swine influenza virus

表2 不同饲养模式猪血清中新甲流抗体水平表Table 2 Antibody level against new type A In fl uenae Virus in different breeding model

图2 不同饲养模式猪血清中新甲流抗体变化趋势图Fig.2 Change trend of antibody against new type A influenza Virus in different breeding model

2.3 新甲流HI抗体检测结果显著性检验显示，1组和2组之间差异不显著，而2组和3、4、5组之间均存在显著差异（P<0.05）。由此可见，新甲流病毒因为为2009年5月这一时间点前后在猪群中感染，这一现象与人群感染情况趋同，说明该病毒不仅能在人群中感染，也能在猪群中广泛传播。新甲流爆发后，国内人群中新甲流病毒阳性率从4.4%至9%不等[5,6]，这一水平远低于本实验中猪群的抗体阳性水平。这种现象的形成一方面是因为人群接种了甲型流感疫苗，控制了该病的传播；另一方面是由于猪群饲养密集，易于感染病毒。而猪群是否是感染人的源头，该病是否还感染其他畜禽，这些问题尚有待进一步研究。

2.4 本文首次证实上海地区猪群不仅存在不同程度上的新甲流病毒感染，而且感染后的抗体水平高低与猪群的饲养模式有关。猪群饲养周期以及群饲养密度情况显著影响抗体水平，猪群饲养周期长、养殖密度大会增加新甲流病毒感染几率，导致感染抗体水平升高。

本研究首次将血凝抑制试验应用于猪体内新甲流病毒抗体检测，为新甲流病在家畜中的流行病学研究打下了基础。在人畜共患病的流行过程中，人群中的病毒流行株消失后，往往会在家畜和宠物等动物体内保持很长时间。由于猪体可以同时感染不同来源、不同亚型的流感病毒，是人、禽、猪流感病毒间发生基因重组的“混合器”，是人流感病毒的保存宿主，在适当的条件下，该病毒很有可能会重新在人群中造成流行或形成新的流感病毒株重新感染人群。因此，开展对猪体内新甲型流感病毒感染情况的研究，具有非常重要的公共卫生学意义。

[1]World Health Organization. Influenza A (H1N1)update 33,19, May, 2009[EB/OL]. http :/ /www. who. int/ csr/ don/2009205219/ en/index. html

[2]Brown I H, Ludwig S, Olsen C W, et al. Antigenic and genetic analyses of H1N1 influenza A viruses from European pigs [J]. J Gen Virol, 1997, 78: 553-562.

[3]谢佳新, 殷建华, 李淑华, 等. 2009 年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析[J]. 第二军医大学学报,2009, 30(6): 613-617.

[4]王国戗,牛菊霞,贾安奎. 2009年中国流行的甲型流感病毒(H1N1)血凝素特征分析[J].中国微生态学杂志,2009, 21(11): 998-1000.

[5]金秀国, 李浩孺. 应用EIA法检测舟山地区献血者甲型H1N1流感病毒抗体[J]. 中国输血杂志, 2010, 23(3):178-179.

[6]林艺, 刘倜, 王爽, 等. 山东省甲型H1N1流感隐性感染者抗体调查[J]. 预防医学论坛, 2010 (4): 293-294.