酸性条件下Al3+对苜蓿根瘤菌溶磷和分泌生长素能力的影响

张媚佳，欧冰雷，徐苏凌，方 勇，徐根娣

（1.浙江师范大学地理与环境科学学院，浙江 金华 321004；2.金华职业技术学院农业与生物工程学院，浙江 金华 321007；3.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004）

磷是植物生命活动所需的大量营养元素之一。我国大多数农田土壤磷素含量丰富，但95%以上以无效态积累于土壤中[1]，很难被植物直接吸收利用。目前，向土壤中施加可溶性磷肥是提高作物产量最常用的方法，但该法却不能从根本上解决土壤缺磷的问题，而且还会造成环境污染。研究表明，利用土壤中天然存在的具有溶磷能力的溶磷菌是避免土壤磷污染和解决植物生长缺磷问题的最经济有效的方法。此外，有些溶磷菌还兼具分泌植物生长素（IAA）的功能，对植物生长起到了直接的促进作用[2-3]。

苜蓿根瘤菌是一种良好的生物肥料[4-5]，同时还具有溶磷和分泌IAA的能力[6-7]。目前已有低pH和铝胁迫对苜蓿根瘤菌生长状况的影响的报道，但对低pH下铝胁迫对苜蓿根瘤菌溶磷和分泌IAA能力的影响的研究却不多。本试验从生长在金华酸性红壤上的紫花苜蓿的根瘤中分离筛选出两株根瘤菌S1002和S1007，并以此作为供试菌株，探究了酸性条件下Al3+对根瘤菌S1002，S1007溶解有机磷、无机磷和分泌IAA的能力的影响，旨在为根瘤菌在农业生产中的应用提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 供试根瘤菌取自金华红壤区种植的紫花苜蓿上的根瘤。菌株由实验室分离纯化[8-9]，经耐酸筛选后[10]获得了在pH 5.0的YMA固体培养基上长势最优的两个菌种S1002和S1007作为研究对象。

1.1.2 培养基 有机磷测定培养基采用蒙金娜有机培养基，配方见参考文献[11]；无机磷测定培养基采用PKO（Pikovskaia’smedium）无机培养基，配方见参考文献[11-12]；根瘤菌分泌IAA的能力的测定培养基采用改良的刚果红液体培养基[11]；根瘤菌保存培养基采用YMA固体培养基。

1.2 方法

1.2.1 酸性条件下Al3+对根瘤菌溶磷能力的影响采用溶磷圈法进行溶磷能力的测定。在PKO和蒙金娜的液体培养基中（pH 5.0）分别添加0、3、6、9 μmol/L的AlCl3，添加2%的琼脂粉，经高压灭菌后制成平板备用。将已制备好的根瘤菌悬液用无菌移液枪在无菌条件下点接到PKO和蒙金娜培养基上，每板点植5个点，每个菌种重复3次，于28℃下培养。10 d后测量根瘤菌菌落直径（d）和溶磷圈直径（D），计算根瘤菌菌落溶磷透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值，根据（D/d）值的大小来判定酸性条件下Al3+对两种根瘤菌溶磷能力的影响。

1.2.2 酸性条件下Al3+对根瘤菌分泌IAA能力的影响 采用Salkowski比色法[13]作根瘤菌分泌IAA能力的定性测定。在刚果红液体培养基中（pH 5.0）分别添加0、3、6、9μmol/L的AlCl3，等量分装到150 mL的三角瓶中，经高压灭菌后备用。用移液枪在无菌条件下移取等量的根瘤菌悬液至各三角瓶中，置于转速125 r/min，温度28℃的摇床上培养。培养10 d后，取其菌悬液100μL滴于白色陶瓷板上，加100μL的比色液，在室温下静置15 min后观察颜色变化，每个菌种3个重复。3个重复均变红为阳性，表示能分泌IAA，颜色越深表明分泌量越多，3个重复均不变色为阴性，表示不分泌IAA。

用标准曲线法来作根瘤菌分泌IAA能力的定性分析。标准曲线采用纯3-IAA制作[14]。根瘤菌的测定是将根瘤菌悬液取出后，在10 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL加比色液在黑暗中静置0.5 h，取出立即在波长530 nm下测定吸光度，根据标准曲线得到IAA的分泌量。

1.3 数据分析

数据分析采用Excel2003进行。

2 结果与分析

2.1 酸性条件下Al3+对根瘤菌溶磷能力的影响

菌株的溶磷圈直径（D）和菌落生长直径（d）的比值（D/d）是表征菌株的溶磷效果的重要指标[15-16]。从图1可以看出，分离筛选出的两个菌株S1002和S1007都能溶解有机磷和无机磷，且溶解无机磷的能力强于有机磷。在相同条件下，S1007的溶磷量大于S1002，表明菌株S1007具有更优的溶磷效果。随着Al3+浓度的增加，S1002和S1007的溶磷量降低，表明两种菌株对Al3+有一定的耐受性，但其溶磷作用受到了抑制。

图1 两种根瘤菌在不同Al3+浓度下的溶磷量

2.2 酸性条件下Al3+对根瘤菌分泌植物IAA能力的影响

通过试验对两种耐酸根瘤菌分泌植物IAA能力进行了定性和定量的测定。结果如表1所示，在Al3+浓度较低的情况下，菌株S1002和S1007仍具有分泌IAA的能力，但随着Al3+浓度的增加，IAA的分泌量减少，当Al3+浓度达到9μmol/L时，不能观察到显色变化。

表1 两种苜蓿耐酸根瘤菌分泌IAA的能力

定量测定结果与定性测定结果基本一致（图2）。随着Al3+浓度的增加，两者的IAA分泌量减少，但在Al3+浓度为9μmol/L时，定量测定时仍可检测到IAA，该结果与定性测定结果不一致，这表明IAA需要累积到一定量时才能通过Salkowski比色法检测到。由此可见，定量测定的结果更为准确。

3 讨论

图2 两种根瘤菌在不同Al3+浓度下的IAA分泌量

近年来，已有众多学者通过研究发现，苜蓿根瘤菌具有促进苜蓿、小麦[17]、燕麦[18]、鸡骨草[19]等多种植物生长的作用。在中性条件下，部分苜蓿根瘤菌不仅具有固氮活性，而且还具有溶磷作用[11]。本试验采用溶磷圈法，以分离得到的两株在pH 5.0的TMA培养基上生长最优的根瘤菌菌株作为研究对象，探究了酸性条件下Al3+对两种根瘤菌溶磷的影响，结果发现：（1）两个菌株都具有较强的溶磷能力，且溶解无机磷的能力强于溶解有机磷的能力，这可能是因为苜蓿根瘤菌的共生特性使之倾向于与无机体结合，因而强化了溶解吸收有机体营养元素的能力。（2）酸性条件下Al3+的存在对两个菌株的溶磷作用均具有一定的抑制作用，且这种抑制作用随着Al3+浓度的增加而增强，但当Al3+浓度增加到9μmol/L时，两个菌株的溶磷量却增加了。分析原因可能是因为随着Al3+浓度升高，毒害作用增强，进一步刺激根瘤菌分泌出了柠檬酸等具有解铝毒作用的酸，从而减小了Al3+对根瘤菌的毒害作用，对其溶磷的抑制作用也相应的降低[20]。

本试验采用Salkowski比色法和标准曲线法，对根瘤菌在不同Al3+浓度下分泌植物IAA的量分别进行了定性和定量的测定，发现两种苜蓿根瘤菌在酸铝胁迫下仍具有较强的分泌IAA的能力。在酸性条件下，Al3+对两种根瘤菌分泌IAA具有抑制作用，且这种抑制作用随着Al3+浓度的增加而增强。此外，通过比较发现，S1007分泌IAA的能力大于S1002，分析原因可能是因为S1007的生长较S1002旺盛，因而分泌IAA的效率更高，产量更多。

综上所述，菌株S1002和S1007均具有较为优异的溶磷和分泌IAA的能力，且溶解无机磷的能力更强；溶磷和分泌IAA的能力都会受到Al3+的影响，Al3+浓度增加，抑制作用增强；菌株S1007的溶磷和分泌IAA能力均较S1002强，表明菌株S1007的性能更优。

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