莽草酸发酵培养基的最佳碳氮源筛选

赵现方,王艳婕,武忠伟,王振河,陈冰冰

（河南科技学院,河南新乡453003）

2009 年墨西哥暴发流感疫情,并迅速向全球蔓延.中国卫生部和世界卫生组织向全球推荐达菲为抗甲型H1N1首选药物之一[1],同时达菲也是禽流感的特效药之一[2].莽草酸作为合成达菲的前体物也受到人们的重视.目前,莽草酸的制备方法有植物提取法[3]、化学合成法[4]、微生物代谢合成法[5].用植物提取法和化学合成法获得莽草酸的成本较高,难以适应大规模生产的要求.因此,微生物莽草酸代谢途径,由较廉价碳源大规模发酵生产莽草酸是解决市场需求的有效途径.国外已有较多关于莽草酸生物合成方面的研究报道,主要的方法有2种：一种是阻断由莽草酸激酶催化的莽草酸向下游代谢产物3-磷酸莽草酸（S3P）的转化,如在大肠杆菌中敲除编码莽草酸激酶的aroL和aroK基因或在芽孢杆菌中随机敲除合成酶的aroA基因,使S3P积累,然后通过加热或酸化将S3P转化为莽草酸[6-9]；另一种是利用随机突变的方法分别将枯草芽孢杆菌及弗罗因德（氏）枸橼酸杆菌进行突变,使莽草酸激酶失活从而获得莽草酸工程菌[9],但是实际应用于生产的还比较少.本课题组分离到一株莽草酸高产菌株,小试结果显示可以达到68.01 mg/L（未发表数据）,在国内处于领先水平.在此基础上,本试验优化该菌株的发酵培养基,以期能进一步提高莽草酸的产量.

1 材料和方法

1.1 试剂及基础培养基

基础培养基：磷酸氢二钠10 g/L,磷酸氢二钾3 g/L,氯化钠0.5 g/L,氯化铵1 g/L,葡萄糖4 g/L,pH7.2.

碳源培养基：分别利用葡萄糖,果糖,甘油,蔗糖,淀粉,羧甲基纤维素钠代替基础培养基中的葡萄糖,并维持浓度不变.如此可以配制6种碳源培养基.

氮源培养基：分别利用牛肉膏,酵母膏,蛋白胨,豆饼粉,草酸铵,氯化铵,硫酸铵,硝酸钠代替基础培养基中的氯化铵,并维持浓度不变.如此可以配制8种碳源培养基.

磷酸水（2.87 g磷酸钠加入800 mL的纯水,用85℅（w/w）磷酸调pH至2.2）.

1.2 主要仪器

2010-CHT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ODC-C18反相色谱柱（SepaxTechnologiesIncorporation）.

1.3 莽草酸标准曲线的绘制

利用莽草酸标准品（Sigma公司）分别配制质量浓度为 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/L的溶液.采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法[10-11]检测莽草酸的含量.检测波长为210 nm；柱温设定为25℃；流动相为V（磷酸水）∶V（甲醇）＝98∶2；流速为 1 mL/min；每次进样 10 μL,峰值半保留时间 2.908 min.检测结果由LC-Solution软件统计分析,并绘制标准曲线.

1.4 试验方法

上述6种碳源培养基和8种氮源培养基每种体积为90 mL.将活化菌种（本实验组自分离菌种,未命名）制成菌悬液,分别接种10 mL,并加30%草甘膦（安阳市安林化工有限公司）溶液10 mL.设定4个重复.37℃,静止发酵24 h.

发酵液通过离心（6 000 r/min,离心10 min）处理后,用苯对发酵液进行除杂,再用孔径为450 nm的膜过滤；最后采用高效液相色谱法,测定每个样品,检测条件同1.2.1,检测结果同样由LC-Solution软件分析.数据由SPSS13.0软件处理.

2 结果与分析

2.1 不同碳源对莽草酸产量的影响

不同碳源对莽草酸产量的影响结果见表1.

表1 不同碳源对莽草酸产量的影响 mg/L

由表1可以看出,葡糖和果糖作为碳源,对莽草酸的产量影响最大,产量分别为1.43mg/L和1.50 mg/L.其次是双糖的蔗糖,为0.34 mg/L.但对于甘油以及多糖的羧甲基纤维素钠利用率较小,其产量分别仅为0.08和0.05 mg/L.该菌不能利用淀粉,说明它不能分泌胞外淀粉酶.从产量上看,葡萄糖和果糖产量较高,但是由于果糖价格太高,不适于作为后续大规模生产的碳源,所以采用葡萄糖作为后续试验碳源.

2.2 不同氮源对莽草酸产量的影响

不同氮源对莽草酸产量的影响结果见表2.

表2 不同氮源对莽草酸产量的影响 mg/L

由表2可以看出,以蛋白胨为氮源的培养基进行发酵,莽草酸的产量达到134.58 mg/L,比其他氮源的影响大,且与其他氮源的影响具有显著性差异.其次是牛肉膏,以牛肉膏为氮源,发酵后测得莽草酸含量为36.12 mg/L.以豆饼粉为发酵培养基,莽草酸产量较低,为1.48 mg/L,这可能与豆饼粉的溶解度有关.但是,同为天然混合氮源的酵母膏对莽草酸的产量影响甚微,发酵结果显示其产量为0.70 mg/L,这可能与酵母膏中含有某些抑制莽草酸产生的物质有关.在无机氮源中,氯化铵和硫酸铵对莽草酸的产量影响较大,产量分别达到了2.36 mg/L和1.22 mg/L.其次是硝酸钠和草酸铵,产量分别为0.53 mg/L和0.40 mg/L.综合考虑各种因素,后续试验将以蛋白胨作为氮源.

3 小结

本试验通过对培养基成分的单因素优化试验,选取葡萄糖作为碳源,选取蛋白胨作为氮源.因此培养基的基本成分分别为：葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氯化钠.每种成分的浓度将通过后续的试验获得.

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