携带BARF1基因的人胃上皮细胞株的建立*

李淑英,张 科,杜海军,王 湛,慈雅丽,王新燕,周 玲,曾毅

2.中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤病毒室,传染病预防控制国家重点实验室病毒性肿瘤组,北京 100052

BARF1是EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)编码的Bam HIA区域的早期裂解基因,是近年来确认的EBV新的致癌基因,在EBV阳性肿瘤发生、发展过程中可能起重要作用[1-3]。通过构建携带BARF1基因的真核表达载体,转染人胃上皮细胞,G418筛选后,获得稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株,而探讨BARF1基因对人胃上皮细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 引物设计与合成 根据GenBank提供的BARF1基因序列,设计扩增目的基因BARF1的特异性引物,并在引物两端添加酶切位点,引物序列见表1。

引物设计后,委托上海生工生物技术有限公司合成。

1.2 携带BARF1基因真核表达载体的构建与鉴定 提取B95-8细胞RNA(按试剂盒说明书操作)。RT-PCR扩增cDNA。以此cDNA为模板扩增目的基因BARF1,目的基因BARF1扩增产物与pUMT载体克隆反应(按试剂盒说明书操作)。碱裂解法提取质粒;对所提质粒进行PCR、酶切及测序鉴定(委托北京百泰克生物计划有限公司测序)。

将上述质粒进行双酶切,并回收产物BARF1片段(按试剂盒说明书操作)。用EcoRI和XbaI进行双酶切真核载体pcDNA3.1(+)-his,并进行回收。将回收BARF1片段与pcDNA3.1(+)-his片段按表2连接,连接产物转化感受态E.coli DH5α,在含有氨苄青霉素的LB平板中筛选,用含有氨苄青霉素的LB液体培养基培养,碱裂解法提取质粒;对所提质粒进行酶切鉴定。

表1 本研究中使用的扩增引物Table1 The primers used in this study

表2 真核载体 pcDNA3.1(+)-his与BARF1连接体系(20μ L)Table2 The vector pcDNA3.1(+)-his connected with the BARF1 gene(20μ L)

1.3 细胞培养 人胃上皮细胞GES-1培养在DMEM培养液中(添加10%灭活的小牛血清,100 u/mL青霉素和100 u/mL链霉素)。培养于37℃,5%CO2的温箱中,每2～3d换液1次。

1.4 细胞的转染、克隆及鉴定 用 lipofectamine2000介导,将pcDNA3.1(+)-his空载体及携带目的基因BARF1的真核表达载体转染人胃上皮细胞GES-1(按试剂盒说明书操作)。用有限稀释法进行克隆,转染后第3d将细胞消化分散,按每孔200个细胞接入48孔细胞培养板,用含有300μ g/mL的G418培养液进行筛选,每 2-3d换1次液,长出抗性克隆后扩大培养。

将抗性克隆细胞扩大培养后,提取细胞RNA,RT-PCR鉴定BARF1基因的表达,所用引物如表1中BARF1#3与#4。

1.5 绘制细胞生长曲线检测BARF1基因对细胞增殖的影响

1.5.1 细胞计数法绘制生长曲线 取生长状态良好的细胞,采用一般传代方法消化细胞,制成细胞悬液,使其浓度为1×103个细胞/mL。取24孔培养板,每孔接种浓度为1×103个细胞/mL 500μ L,每种细胞(未转染细胞、转染空载体细胞及转染目的基因的细胞)分别接种4个复孔。每天取各孔细胞计数,测出每孔中的细胞总数,求出每组平均值,持续计数6d。将每天计数所得的细胞浓度标在对数坐标纸上,然后将各点连成曲线,即为生长曲线。

1.5.2 CCK-8法绘制生长曲线 取对数生长期的细胞,用0.25%胰蛋白酶(含有0.02%EDTA)消化单层培养细胞,用含10%血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液,浓度为3×103个细胞/ml的细胞接种于96孔培养板中,每孔加入200μ L,每种细胞设置4个复孔;空白对照孔只加DMEM培养基。将培养板移入CO2孵箱中,37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。分别在细胞培养24h、48h和72h后,每孔加入CCK-8溶液10μ L(注意在孔中不要有气泡生成),37℃,继续孵育 3h,用酶标仪测定450nm处的吸光度,记录结果。以培养时间为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制出细胞增殖曲线。

1.6 统计学处理 以 Excel建立数据库,应用SPSS 13.0软件进行统计学分析,所有数值以均数±标准差(±s)表示;组间计数资料采用χ2检验,计量资料采用t检验,以P＜0.05为差异有显著性,以P＜0.01为差异有极统计学意义。

2 结 果

2.1 BARF1基因真核表达载体的构建与鉴定

2.1.1 细胞RNA提取 将所提RNA进行琼脂糖凝胶电泳得到28S、18S和5S三条带。图1显示B95-8是B95-8细胞提取的RNA,实验提取 RNA完整,无明显降解现象。

2.1.2 目的基因的扩增 以RT-PCR所得cDNA为模板扩增目的基因,经琼脂糖凝胶电泳,得到大小约为666bp的片段,图2,同预期结果一致。

2.1.3 BARF1基因的T-A克隆与鉴定 为了验证目的基因是否已经被成功连接到pUM-T原核载体上,我们对提取的质粒进行了BARF1基因的扩增鉴定,经琼脂糖凝胶电泳得到大小为524bp的片段,与预期片段大小相一致,说明BARF1基因已克隆到pUM-T载体。

2.1.3.1 双酶切鉴定 为了进一步证实BARF1基因已克隆到pUM-T载体,我们对提取的质粒进行双酶切,并对酶切产物进行电泳,琼脂糖凝胶电泳结果,得到3个不同的片段,其大小分别为3.4kb(可能为未被切的质粒)、2.7kb(与pUM-T载体大小相一致)及666bp(与插入的目的基因大小一致)。

2.1.3.2 测序鉴定 将所提质粒测序后与Gen-Bank中的 B95-8细胞株的基因序列同源性为100%。

2.1.4 BARF1真核表达载体的构建与鉴定BARF1与真核表达载体pcDNA3.1(+)-his连接、转化感受态E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选后,对所提质粒进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳得到5.4kb及666bp两个片段,图3。

图3 真核质粒双酶切鉴定Fig.3 Identified eukaryotic plasmid by double enzyme digestion

2.2 转染细胞鉴定BARF1基因的表达 G418为新霉素类似物,可以杀死没有其抗性的细胞,而我们构建的BARFl真核表达载体和空载体pcDNA(3.1)-his均具有neo抗性,所以通过G418可以筛选出阳性克隆细胞。约2w后即可看到有G418抗性克隆出现,而没有成功转染的细胞均已死亡。每种转染细胞分别挑出3个单克隆扩大培养。

从阳性克隆细胞(包括BARFl转染的细胞和空载体转染的细胞)及未转染细胞 GES-1中提取RNA,逆转录,以逆转录产物为模板 PCR扩增BARF1。扩增BARFl用表1中引物3与4,扩增长度为524 bp,图4,Neg是以无菌双蒸水为模板的阴性对照,B95-8是以B95-8细胞的cDNA为模板的阳性对照,1是GES-1细胞cDNA为模板的扩增,2是转染空载体细胞cDNA模板的扩增,3,4,5分别代表转染BARF1基因细胞的cDNA模板的扩增。

图4 转染细胞鉴定BARF1基因的表达Fig.4 Identified BARF1 gene for transfected cells

2.3 转染细胞生长曲线的绘制

2.3.1 细胞计数法 将转染了BARF1基因组细胞、对照组正常GES-1细胞和空载体质粒转染GES-1细胞接种于24孔板,各组细胞同步化,使细胞处于同一个生长状况后,分别以培养1,2,3,4,5,6d的4个重复孔细胞数的均数作图,绘制生长曲线,可见:培养3d后,转染了BARF1基因组的细胞数量及TPA刺激的转染了BARF1基因组细胞数量,开始超过了对照组正常GES-1细胞和空载体质粒转染GES-1细胞的数量,随着培养时间的增加,这一差异越来越大。提示:转染了BARF1基因的GES-1细胞及其TPA刺激组细胞生长速度比对照组正常GES-1细胞和空载体质粒转染GES-1细胞加快,图5。

2.3.2 CCK-8法 将转染了 BARF1基因及其TPA刺激组细胞和对照组正常GES-1细胞和空载体质粒转染GES-1细胞接种于96孔板,各组细胞同步化,使细胞处于同一个生长状况后,分别以培养24h,48h,72h后的4个重复孔先后加入CCK-8后的OD值的均数作图,绘制生长曲线,可见:各组细胞先后加入CCK-8后的OD值在细胞培养了1d后,转染了BARF1基因及其TPA刺激组的OD值开始超过了对照组正常GES-1细胞和空载体质粒转染GES-1细胞的OD值,随着培养时间的增加,这一差异越来越大。提示:转染了BARF1基因及其TPA刺激组细胞生长速度比对照组正常GES-1细胞和空载体质粒转染GES-1细胞快,表3。

图5 细胞计数法绘制各组细胞生长曲线Fig.5 The growth curve of different groups of cells detected by the method of cell counting

表3 通过CCK-8法计算不同培养时间细胞的数量(±s)Table 3 The quatitiesof different group cellsat different time by the method of CCK-8

表3 通过CCK-8法计算不同培养时间细胞的数量(±s)Table 3 The quatitiesof different group cellsat different time by the method of CCK-8

Note:Compared with the control groups,*P＜0.05,Compared TPAGES-1/BARF1 with GES-1/BARF1 group,△P＜0.05

组别 24 h 48 h 72 h GES-1 0.86±0.28 1.12±0.30 1.28±0.33 GES-1/P cDNA3 0.92±0.36 1.18±0.41 1.23±0.41 GES-1/BARF1 1.48±0.21* 1.76±0.28 1.89±0.29*TPA-GES-1/BARF1 1.59±0.45*△ 1.88±0.29*△ 1.98±0.42*△

3 讨 论

EB病毒是一种致瘤病毒,该病毒DNA以线性双链的构型存在,基因组大小为172kb。BARF1是近年来确认的EBV新的致癌基因,其致癌作用日益受到关注。李友琼等[4]将BARF1基因转染胃癌细胞系SGC7910后,能够全面增强胃癌细胞的肿瘤原性。

由于目前BARF1基因在胃癌发生发展中的确切作用尚不清楚,并且在体内研究某一单个基因较为困难,我们通过构建携带BARF1基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-his/BARF1,建立了稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株,从而建立了BARF1基因致瘤的体外模型,可进一步研究BARF1基因在胃癌发生发展中确切作用。

本次研究采用的脂质体介导法转染细胞,该方法具有较多优点:操作简便,转染效率比较高,对细胞类型运用范围广,对转染的核酸类型和分子量有很高的包容性,细胞毒性小。其原理是阳离子脂质体表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用,将DNA分子包裹入内,形成DNA-脂复合体,也能被表面带负电荷的细胞膜吸附,再通过融合或细胞内吞作用进入溶酶体。内吞后的DNA-脂复合体在细胞内形成的包涵体,在辅助脂质体二油酰磷脂已醇胺(DOPE)作用下,细胞膜上的阴离子脂质因膜的不稳定而失去原有的平衡扩散进入复合体,与阳离子脂质中的阳离子形成中性离子对,使原来与脂质体结合的DNA游离出来,进入细胞质,进而通过核孔进入细胞核,最终进行转录并表达。

G418是一种氨基糖类抗生素,其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似,它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动 neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。

通过绘制细胞生长曲线发现,转染了BARF1基因及其TPA刺激组的细胞,经过一定时间培养后,超过了对照组正常GES-1细胞和空载体质粒转染GES-1细胞的增殖速度,随着培养时间的增加,这一差异越来越大,3d后这一差异明显,提示:转染了BARF1基因及其TPA刺激组细胞生长速度比对照组正常GES-1细胞和空载体质粒转染GES-1细胞加快,可能是BARF1基因可以促进细胞增殖的原因。

[1]Seto E,Yang L,Middeldorp J,et al.Epstein Barr virus(EBV)encoded BARF1 gene is ex pressed in nasophary ngeal carcinoma and EBV-associated gastric carcinoma tissues in the absence of lytic gene expression[J].J Med Virol,2005,76(1):82-88.

[2]Fio rini S,Ooka T.Secretion of Epstein Barr virus-encoded BARF1 oncoprotein from latently infected B cells[J].Virol J,2008,5(70):1186-1743.

[3]宋立兵,李隽,曾木圣,等.EB病毒编码的BARF1基因在人支气管上皮细胞恶性转化和肿瘤形成中的作用[J].癌症,2004,23(11):1361-1364.

[4]李友琼,张雪怡,曾健,等.EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞株SGC7910生物学行为的影响[J].江苏大学学报(医学版),2009,19(3):214-219.