中国美利奴羊CTNNB1基因SNP与羊毛直径关联分析

张艳花，王力俭，徐新明，玛尔孜亚，于丽娟，拉扎提，阿扎提，周喜荣，田可川

（新疆维吾尔自治区畜牧科学院，乌鲁木齐 830000）

近年来细毛羊育种者不断探索通过分子育种手段寻找控制羊毛纤维直径性状的基因或标记来提高育种效率［1］。CTNNB（β-catenin）基因作为影响毛囊发育的 Wnt蛋白信号［2］通路中心环节［3-4］，对毛囊发育、毛囊生长起着重要作用［5］。研究发现WNT/β-catenin对毛囊再生时真皮乳头的诱导特性的维持是必要的，毛囊形态发生过程和毛囊再生形态和信号的表达具有很大的相似性，β-catenin在表皮层化后未出现基板形态之前首次均一散在出现于临近表皮的真皮间充质细胞。随着表皮基板增厚，基板部位β-catenin信号的上调，散在表达的WNT/β-catenin 信号消失［7］。基板形成后，基板下部开始聚集的间充质细胞，间充质细胞聚集一定数量后也开始表达β-catenin。随后毛囊开始下陷，形成毛芽。伴随着毛囊下陷，β-catenin表达消失一段时间；毛囊成形后毛球部位出现毛囊圆锥时再次在圆锥部位出现。随后毛母质、前皮质区、根鞘都出现WNT/β-catenin信号的表达上调。这种上调表达一直持续到毛囊成熟毛纤维形成毛干［4］。但CTNNB1基因作为影响羊毛直径性状的候选基因在国内尚未见有关研究报道。本研究拟通过以CTNNB1基因为候选基因，利用中国美利奴羊中发现的多态位点，运用最小二乘均值分析各多态位点与产毛性状之间的关系，找到与产毛性状相关联的标记位点，以进一步提高细毛羊的生产性能，改善羊毛品质，为细毛羊经济性状的早期标记辅助选择提供理论依据和技术贮备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源及采样方法 实验采集新疆巩乃斯种羊场有系谱记录的中国美利奴羊874只，实验羊群体为周岁母羊。一次性针头采集羊颈静脉血液2mL，放入医用肝素钠抗凝试管，上下颠倒5次确保抗凝，放入-20℃冰箱保存。同时采集每一只羊体侧毛样，用光学纤维直径分析仪（OFDA100）测定分析该毛样羊毛平均纤维直径。

1.1.2 主要试剂 DP319血液基因组DNA提取系统、dNTPs、TaqDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶反应缓冲液、DNA分子量标准（MarkerⅠ、MarkerⅣ）均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组提取 采用天根生化科技（北京）有限公司DP319血液基因组DNA提取系统，提取基因组DNA。应用紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度并估计含量，利用核酸蛋白定量仪测定其含量，稀释到 100 ng/μL。

1.2.2 引物设计 根据Genbank公布的羊CTNNB1基因，得到mRNA部分序列（GQ372826.1），长度约为407bp，在NCBI及UCSC上查找比对，寻找与该基因同源性较高的物种的基因，通过比对发现绵羊CTNNB1基因mRNA序列与牛CTNNB1基因高度同源。以牛CTNNB1基因为参考序列，以羊的mRNA部分序列为模板，分3段设计引物。利用在线引物设计程序（http：//fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm）初步设计了32对引物，通过oligo6软件检测，选取合适引物6对，通过实验筛选，最终确定了3对引物，如表1所示。

表1 CTNNB1基因测序引物序列

1.2.3 PCR过程 利用设计的3对引物进行扩增。预期的PCR产物长度为300 bp、1 200 bp、2 000 bp。反应体系：l0×Buffer扩增缓冲液2.0 μL，Mg2+（25 mM）1.2 μL，dNTP 混合物（2.5 mM）1.5 μL，10 pmol/μL 上下游引物各1.0 μL，TaqDNA 聚合酶（5u/μL）0.2μL，模板 DNA（100 ng/μL）1.0 μL，ddH2O 12.1μL。反应条件：①200～600 bp 片段，95 ℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；②1 000～2 500 bp 片段，95 ℃ 8 min；95℃ 45 s，55 ℃45 s，72℃2.5 min，38个循环。根据扩增效果筛选3对引物用于后续实验。

1.2.4 SNP位点筛选及分型检测 随机从13个不同公羊的女儿中，选取羊毛纤维直径差异较大的40个个体的基因组，从每个DNA样本中选取5 μL共200 μL的DNA混合构建成DNA池。选取扩增效果较好的3对引物进行扩增，将扩增产物分装，各30 μL分别送至擎科生物公司及华大公司测序，分析测序峰图查找SNP位点。根据检测结果，使用美国西昆诺姆公司的Mass ARRAY对实验群体进行SNP分型检测，然后统计基因型。

1.3 数据分析 统计不同基因型的个体数量，计算基因频率和基因型频率，利用Popgene Version（3.2）软件对SNP位点进行Hardy-Weinberg平衡检验。

采用SAS8.2中的MIXED过程对中国美利奴羊CTNNB1基因SNP位点多态性与羊毛纤维直径、羊毛纤维直径变异系数和羊毛产量性状进行关联分析，具体公式为：

其中，y为性状表型观察值；μ为性状的群体均值；RAM为公羊家系；G为SNP效应；e为随机残差效应。

2 结果与分析

2.1 CTNNB1基因SNP位点多态性检测 对混合池基因组DNA进行扩增，进行正反向测序。用Chromas软件打开测序峰图，用DNAMAN进行序列分析，发现了2个SNP突变位点，分别是819G＞A、974A＞G。

图1 CTNNB1基因池的测序峰图（圈图处为突变位点，为反向测序结果）

2.2 CTNNB1基因SNP位点等位基因频率和基因型频率分析 CTNNB1基因的2个SNP多态位点中819G＞A突变位点处于Hardy-Weinberg平衡状态，974A＞G位点处于极不平衡状态，突变位点G等位基因频率（0.30）明显低于野生型A等位基因频率（0.70）。

表2 SNPs等位基因频率和基因型频率及Hardy-Weinberg平衡检验

2.3 基因多态性羊毛直径性状的关联分析 多重比较分析表明，CTNNB1基因974A＞G位点的AA基因型羊毛纤维直径显著低于GG及GA基因型、819G＞A位点的GA基因型羊毛纤维直径显著低于AA基因型。等位基因替代效应分析表明CTNNB1基因819G＞A位点对羊毛纤维直径加性效应达到极显著水平，显性效应达到显著水平，等位基因由A变为G时羊毛纤维直径会降低。

表3 CTNNB1基因SNP位点对羊毛纤维直径性状的影响

表4 CTNNB1基因SNP位点在羊毛纤维直径性状上的加性效应和显性效应

3 讨论

1）CTNNB1基因作为影响羊毛直径性状的候选基因，在国内属首次研究。本研究发现CTNNB1基因上与羊毛纤维直径相关的2个SNP突变位点，表明CTNNB1基因与羊毛纤维直径性状有着较强的关联。

2）本研究首次发现CTNNB1基因上819G＞A位点GA基因型羊毛纤维直径显著低于AA基因型，974A＞G位点的AA基因型羊毛纤维直径显著低于GG及GA基因型。因此CTNNB1基因作为新的影响羊毛纤维直径的候选基因值得进一步探讨，本研究为CTNNB1基因位点应用于羊毛纤维直径标记辅助选择提供了一定的参考。此外作为影响毛囊发育的Wnt蛋白信号通路中心环节基因CTNNB1，值得进一步采取定量分析研究其影响羊毛纤维直径的机理。

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