犬细小病毒的培养

2011-06-02刘忠平李建荣段银河李正金

中国畜牧兽医文摘 2011年5期

刘忠平李建荣段银河李正金

（1.云南省马龙县畜牧兽医局马过河畜牧兽医站，马龙 655100；2.云南省马龙县畜牧兽医局，马龙 655100；3.云南省马龙县畜牧兽医局通泉畜牧兽医站，马龙 655100）

犬细小病毒（canine Parvovirus，CPV）属于犬细小病毒科（Pavoviridae）细小病毒属（Parvovirus）是一种自主性复制病毒。1977年，美国Eengster首次报道了犬细小病毒（CPV）与犬出血性肠炎的联系，自1978年中期起，全世界广泛地区几乎同时在所有年龄犬中爆发严重的出血性肠炎。据报道我国最早于1980年流行该病。1982年和1983年梁士哲、朱维正等和徐汉坤等确认流行的犬出血性肠炎原为CPV。它是引起犬心肌炎，出血性肠炎和肺病而使犬大量死亡的重要原因，从而给养犬业和宠物业带来巨大损失。发病率高达20%～100%，死亡率为10%～50%，在幼犬中本病的死亡率较任何其他传染病高。患犬典型表现为呕吐，腹泻，粪便呈红色胶冻样。剖检可见肠管膨大，肠壁上充血或出血，肠道内充满着胶冻状内容物或血水，4～6周龄幼犬剖检后可见心室扩展，怀疑为犬细小病毒感染引起的出血性肠炎和心肌炎。

犬最易感凡是养犬的地方都有本病的发生，特别常见于城市或犬类比较集中的地方。不同年龄、性别和品种的犬都可感染。但2月龄以内的仔犬由于母源抗体的保护，80%不受感染3～12月龄的幼犬易感性高，犬细小病康复犬可获终身免疫力。本病多发生于寒冷季节，有一定的周期性，每2～3年流行1次，但有些地方这种周期已经不明显，常年发生。因此，对犬细小病毒的研究和防治十分重要，做好病毒培养是做研究的前提。

1 材料与方法

1.1 材料

犬细小病毒、胎猫肾传代细胞（FK81）（由成都军区联勤部军事医学研究所提供）。

原料洗液、营养液、NaHCO3溶液、血清抗生素。

仪器与设备无菌操间、CO2温箱、冰箱、吸耳球、水浴锅、灭菌5ml、10ml吸管、灭菌中号培养瓶、瓶塞、酒精灯、高压灭菌锅、显微镜。

1.2 方法

1.2.1 洗液的配制

以上成分依次溶于450ml三馏水中，为使胰酶充分溶解可至于37℃水浴中加温，务使溶体完全清凉，随后加入1%酚红1 ml再加10万 U双抗溶液5 ml加三馏水至500 ml，以G-6玻璃滤器或相应的滤膜滤过除菌，分装后置-20 ℃保存临时用蒸馏水稀释。

1.2.2 营养液的配制

称E-EME培养基48 g溶于5 000 ml新烧的蒸馏水中，充分摇匀混均分装在500ml的葡萄糖瓶中，每瓶装400 ml密封起来放在小高压锅中灭菌，温度调到121℃灭菌15 min即可。取出凉冷，然后往每瓶中依次加如以上溶液混合摇匀之后，放入冰箱中低温保存备用。

2 细胞和病毒的培养

2.1 胎猫肾传代细胞（FK81）的培养

培养细胞胎猫肾传代细胞（FK81）来自于成都军区病毒研究所，其传代时需要0.25%的胰酶消化，细胞生长夜为含有8%的小牛血清、各为100 ug/ml的青、链霉素和L-谷胺酰胺（补加30 ug/ml）DMEM，维持液为含90 ug/ml的L-谷胺酰胺DMEM。此细胞具有分离CPV的作用。

2.2 犬细小病毒的培养

病毒增殖采用同步接毒的方法，在细胞传代的同时接种样品，加入生长液，24小时后，将生长液弃去换上维持液，5天后收获病毒。用此方法反复增殖病毒，用于纯病毒。

3 结果与分析

3.1 结果

一般把犬细小病毒接种到FK81细胞中置于37 ℃的温箱中培养，每天都要检查，观察2～5 d内有无圆形多核巨细胞和空泡形成，并在胞浆内出现包涵体，形状好似一个个蜘蛛。巨细胞容易脱落，而且并非所有的细胞都形成巨细胞，故应多次仔细检查，同时用荧光抗体或琼脂扩散实验检测病毒抗原或作电镜检查。从细胞出病变到细胞脱落80%即可放入冰箱中冰冻，收集病毒。