杭白菊水提取物对犬急性心肌梗死后缺血心肌的保护作用

黄 浩 郭环宇 金红峰 浙江医院 杭州 310013

杭白菊（Dendranthema morifolium（Ramat.））是浙江驰名中外的地道药材，为“浙八味”之一，有清热、平肝、明目功能。根据报道，菊花水煎醇沉剂对离体和在体心脏有明显的扩张冠脉及增加冠脉流量的作用，并减慢心率，影响心肌收缩力[1]。但有关杭白菊对心肌缺血后炎症反应的影响及机制方面研究尚未见报道。我们采用在体犬急性心肌梗死模型，观察杭白菊水提物对犬急性心肌梗死后炎症因子IL-6和TNF-α浓度的影响，并进一步研究杭白菊水提取物在保护缺血心肌方面的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物 健康成年比格（Beagle）犬24只，雌雄不拘，体重是10～15kg，由浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药物及试剂 杭白菊水提物：杭白菊由浙江桐乡春发杭白菊制品厂提供，经浙江大学药学院中药研究室鉴定。杭白菊粉碎后，以15倍量蒸馏水，在90℃提取2次，每次1.5h，合并2次滤液，于旋转蒸发器上，减压、55℃以下浓缩至0.25g/mL，以药典方法测得浓缩液pH为5.36，相对密度为1.04；以A1（NO3）3比色法测得总黄酮含量为11.7mg/mL。将上述溶液分装、灭菌，冷藏待用。戊巴比妥钠（上海第四化工厂进口分装，批号F20041216），肝素钠（南京生物化学制药厂，批号000201），氯化三苯基四氮唑（Triphenyl tetrazolium chloride，TTC，Sigma公司，批号f20030102，用磷酸缓冲液（pH=7.4）配置成1%的梗死心肌染色孵育液，避光保存）。伊文思蓝（E-vans blue，中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20030122，用磷酸缓冲液（pH=7.4）配置成1%溶液），76%泛影葡胺（上海旭东海普药业有限公司，批号060203，稀释成50%的注射液）。

1.3 主要器材 C型臂X光机（H5000，PHILIPS公司）；右冠状动脉造影导管，6F指引导管（6F Guiding Catheter）6F 鞘管（6F sheath，6F Dilator），2.5～3mm 球囊导管（PTCA Dilatation catheter），直径 0.036cm 的导丝（0.014 inch Guide Wire）等（Cordis Corporation，USA）。栓子是聚乙烯泡沫（美国），经过环氧乙烷消毒灭菌。

1.4 分组及给药 24只比格（Beagle）犬随机分为假手术组、急性心肌梗死模型组及杭白菊水提物低、高剂量组，每组6只。假手术组手术前以生理盐水10mL/（kg·d）灌胃，只行冠脉造影，不做栓塞，术后普通喂养14天；急性心肌梗死模型组手术前以生理盐水10mL（kg·d）灌胃，术后普通喂养14天；杭白菊水提物低剂量组手术前以生理盐水10mL/（kg·d）灌胃，术后给予杭白菊水提物17mg/（kg·d）灌胃14天；杭白菊水提物高剂量组手术前以生理盐水10mL/（kg·d）灌胃，术后给予杭白菊水提物68mg/（kg·d）灌胃14天。

1.5 急性心肌梗死模型建立[2]各组Beagle犬术前禁食12h，禁水4h，用3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于导管床上，分离颈总动脉，经颈总动脉穿刺，实施冠状动脉介入术，以人工泡沫栓子封堵冠脉左前降支远端1/3处，术中进行持续心电图检测。造模成功标志：造影示球囊远端血流中断；心电监护出现ST段抬高，并且随堵塞时间延长，ST段逐渐升高，与T波融合形成单向曲线。

1.6 标本采集及检测指标 分别于冠脉栓塞前，栓塞后1h、2h、3h及杭白菊水提物干预2周后抽取静脉血，测定血LDH、CK-MB、IL-6和TNF-α水平。心肌梗死面积测定采用EB/TTC双染色法[2]。2周后放血处死动物，迅速开胸取出心脏，用预冷的生理盐水洗净心脏各腔及表面血液，从主动脉根部用注射器匀速推注1%伊文氏蓝溶液。剔除左右心房、右心室、心脏瓣膜、腱索，保留左心室，用滤纸吸去水分，电子天平称重。灌注区染为蓝色，非灌注区不染色。小心将蓝色区与未染色区分离。垂直于心脏长轴，自心尖向心底将左心室横切成0.5cm厚的肌片，将未染色区置入1%TTC磷酸缓冲盐溶液（pH7.4）中37℃恒温孵育20min，则未染色区为梗死区，红色区为未梗死区，红色区和未染色区之和为缺血危险区。冷生理盐水冲去游离染料，吸纸沥干，10%甲醛固定24h。以梗死区心肌占缺血危险心肌重量和面积的百分比作为心肌梗死范围的大小。梗死重量百分比（%）=（梗死区重量（g）÷危险区重量（g））×100%。梗死面积百分比（%）=（梗死区面积（cm2）÷危险区面积（cm2））×100%。

2 结 果

2.1 杭白菊水提物对犬急性心肌缺血引起的心肌梗死范围的影响 与心肌梗死模型组比较，低、高剂量的杭白菊水提物组均可明显降低心肌梗死范围。杭白菊水提物高剂量组心肌重量/面积分别为模型对照组的31.0%和29.6%，杭白菊水提物低剂量组心肌重量/面积分别为模型对照组的49.3%和45.7%，差异均具有统计学意义（P＜0.01），见表 1。

表1 各组犬心肌梗死情况比较（） %

表1 各组犬心肌梗死情况比较（） %

注：与模型组比较，**P＜0.01

组 别 n/只 梗死区重量 梗死区面积假手术组 6 0±0** 0±0**心肌梗死模型组 6 59.02±3.81 61.73±5.86低剂量杭白菊水提物组 6 29.12±4.82** 28.22±3.78**高剂量杭白菊水提物组 6 18.29±3.26** 18.24±4.42**

2.2 造模前后各组血清LDH和CK-MB浓度变化栓塞前各组血清LDH和CK-MB浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。约2h后四组血清LDH和CK-MB开始随时间延长而增高，但假手术组虽有增高趋势但无显著性差异。与假手术组比较，2h后手术组犬LDH和CK-MB升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见表 2、3。

表2 各组造模前后血清LDH浓度比较（） U/L

表2 各组造模前后血清LDH浓度比较（） U/L

注：与假手术组比较，△△P＜0.01

组 别 n/只 栓塞前 栓塞后1h 2h 3h假手术组 6 206.36±13.95 211.78±15.68 248.36±12.70 336.36±23.62心肌梗死模型组 6 209.36±17.85 214.35±44.13 522.43±29.10△△ 805.03±79.02△△低剂量杭白菊水提物组 6 210.66±25.11 205.82±29.04 547.24±29.50△△ 797.99±32.17△△高剂量杭白菊水提物组 6 214.54±28.66 208.62±25.67 518.72±47.28△△ 829.38±53.73△△

表3 造模前后各组血清CK-MB浓度比较（） U/mL

表3 造模前后各组血清CK-MB浓度比较（） U/mL

注：与假手术组比较，△△P＜0.01

组 别 n/只 栓塞前 栓塞后1h 2h 3h假手术组 6 10.98±1.77 10.64±2.57 16.79±2.06 24.79±4.03心肌梗死模型组 6 11.33±1.26 10.22±3.46 35.79±4.28△△ 55.33±7.11△△低剂量杭白菊水提物组 6 11.82±1.47 11.07±3.43 34.73±4.03△△ 59.28±2.18△△高剂量杭白菊水提物组 6 10.66±2.02 10.40±2.02 36.47±2.02△△ 56.77±3.61△△

2.3 犬急性心肌梗死后血清炎症因子变化及杭白菊水提物的影响 心肌梗死各组栓塞后1、2、3h血清TNF-α、IL-6浓度显著高于栓塞前基线水平，并均随时间的延长而增高（P＜0.05，P＜0.01），2周后有所回落，但差异仍显著高于栓塞前（P＜0.05）。与心肌梗死模型对照组比较，低、高剂量的杭白菊水提物组均可明显降低栓塞后2周血清TNF-α、IL-6浓度，此作用呈浓度依赖性（P＜0.05，P＜0.01）,见表 4，5。

3 讨 论

本实验从活体动物的水平证实了杭白菊水提物可明显降低心肌急性缺血后炎症因子TNF-α、IL-6水平。实验结果提示，杭白菊能明显减轻在体动物的心肌缺血损伤，其机制与杭白菊水提物抑制炎症反应、延缓心肌细胞坏死和缺血组织重构的作用有关。

表4 各组血清TNF-α 浓度比较（） pg/mL

表4 各组血清TNF-α 浓度比较（） pg/mL

注：与栓塞前比较，*P＜0.05，**P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 n/只 栓塞前 栓塞后1h 2h 3h 2w假手术组 6 10.26±1.55 9.78±2.07 11.33±0.97 10.84±1.01 10.42±1.97心肌梗死模型组 6 10.73±1.85 14.22±1.13* 16.54±1.90** 22.03±1.02** 18.64±2.13**低剂量杭白菊水提物组 6 10.15±1.91 13.12±1.04* 15.94±1.50** 21.99±2.17** 15.46±1.17*△高剂量杭白菊水提物组 6 10.04±1.86 13.32±1.67* 16.02±2.28** 23.08±1.73** 12.82±2.05*△△

表5 各组血清IL-6浓度比较（） ng/L

表5 各组血清IL-6浓度比较（） ng/L

注：与栓塞前比较，**P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 n/只 栓塞前 栓塞后1h 2h 3h 2w假手术组 6 46.47±2.07 52.22±1.98 60.74±2.26 53.41±2.01 47.62±2.19心肌梗死模型组 6 49.02±2.46 68.72±1.28 117.24±5.60** 160.38±3.73** 88.62±1.67**△△低剂量杭白菊水提物组 6 50.47±1.85 62.24±2.10 120.39±4.12** 163.39±7.02** 121.13±4.13**高剂量杭白菊水提物组 6 48.65±2.11 67.24±2.50 124.46±4.28** 159.99±3.17** 109.82±2.04**△

当心肌细胞由于缺血缺氧发生损伤、坏死时，其细胞膜完整性被破坏，细胞内的大分子物质弥散至心脏间质组织，并进入梗死区的微血管和淋巴管，最后进入血液循环，而在这些大分子物质中，心肌特异性酶是细胞损伤的最佳标志物[3]。血清肌酸磷酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）升高是检测急性心肌梗死敏感指标，目前多用血清肌酸磷酸激酶同工酶（CKMB）[4]。本实验中，CK-MB和LDH水平随手术时间延长而升高，手术组在栓塞后2h开始有显著性差异，说明心肌梗死模型成功，可排除假手术组手术创伤的影响。

据报道[5]，菊花水煎醇沉剂对离体和在位心脏有明显的扩张冠脉及增加冠脉流量的作用，该作用随剂量增大而增强，并减慢心率，影响心肌收缩力。国外学者[6]研究发现从菊花中分离得到的三萜烯二醇、三醇及其相应的棕榈酸酯和肉豆蔻酸酯对由佛波酯（12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA）诱发的小鼠耳水肿具有明显的抗炎作用。而TPA是潜在促肿瘤剂，也是蛋白激酶 C（Proteinkinase C，PKC）激活剂，PKC的活化可促进细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和TGF-β等分泌增加，加重炎症反应和组织细胞损伤[7]。

本研究发现，心肌梗死后血清TNF-α、IL-6浓度显著高于栓塞前基线水平，并均随时间的延长而增高，2周后有所回落，但差异仍显著高于栓塞前（P＜0.05）。血TNF-α浓度在栓塞后1h已有明显升高，较IL-6升高更为显著。提示TNF-α、IL-6是心肌损伤的灵敏指标，TNF-α较IL-6更敏感地反映了心肌缺血坏死的程度。杭白菊水提物低、高剂量组均有明显降低栓塞后2周血清TNF-α和IL-6浓度的作用，此作用呈浓度依赖性。说明杭白菊可抑制TNF-α和IL-6的激活与分泌。

本实验观察到不同剂量杭白菊水提物均有明显降低心肌梗死重量/面积的作用，并可减少心肌梗死区域（P＜0.01）。说明杭白菊可以减少心肌组织的坏死，减少心肌重构，具有保护缺血后心肌组织的作用。这种保护作用与抑制心肌缺血梗死后的炎症反应有关，可能通过抑制炎症因子如TNF-α和IL-6的产生、聚集和释放，而起到对缺血心肌的保护作用。

［1］沈伟桥，孙海燕，汪俏梅，等.杭白菊生物活性成分及药理研究进展.茶叶，2006，32:141-144.

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［5］蒋惠娣，夏强，徐万红，等.杭白菊的心血管药理作用及其机制研究进展［J］.世界科学技术-中药现代化，2002，4（2）:31-33.

［6］Ukiya M，Akihisa T，Yasukawa K，et al.Constituents of compositae plants.2.Triterpene diols，triols，and their 3-o-fatty acid esters from edible chrysanthemum flower extract and their anti-inflammatory effects［J］.J Agric Food Chem，2001，49（31）:87-97.

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