温阳通络方对硬皮病成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及MMP-1mRNA的影响

谢志军 曹灵勇 温成平 范永升 浙江中医药大学 杭州 310053

卞 华 河南南阳理工学院医学院

系统性硬皮病（systemic seleroderma，SSc）是一种以弥漫性皮肤增厚和纤维化为主要临床特征、可影响内脏的难治性结缔组织病。细胞外基质（ECM）的过度沉积，是其重要环节之一[1-3]。我们临床应用温阳通络方治疗该病，取得一定疗效，并采用血清药理学方法探讨该方对硬皮病患者皮损组织成纤维细胞胶原合成的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 含药血清制备 12例SSc患者分成SSc对照组（初诊未治疗者）、西药组、中药组、中西药联合组，每组3例。西药组口服青霉胺（1次0.125g，1天3次）和强的松（1次20mg，1天1次）；中药组给予温阳通络方煎剂（基本方：黄芪15g，桂枝10g，仙灵牌、桃仁各12g，丹参20g，积雪草12g，白芥子10g，香附15g，全蝎 3g。水煎服，1天 1剂，早晚各 1次）。中西药联合组给予青霉胺、强的松和温阳通络方煎剂（剂量、用法与西药组、中药组相同）。疗程均2个月。

空腹抽取SSc对照组患者静脉血，经2000r/min离心15min，分离血清，56℃水浴灭活补体，-20℃保存备用；西药组、中药组、中西药联合组经治疗2个月后，空腹抽取静脉血，血液标本处理同上，制备含药血清。

1.2 皮肤成纤维细胞系原代培养 在局麻无菌条件下，分别切取一名24岁男性包皮过长者的正常包皮和一名36岁女性肢端型SSc患者腹股沟处活动性硬化皮损组织，剪去表皮及皮下脂肪组织，将组织块反复剪碎成浆，梅花状滴入25mL的培养瓶中，各点间距约0.5cm，再加入含20%的DMED培养基1.5mL，置37℃、5%CO2培养箱中，4～6h贴壁后，使培养基浸入真皮皮浆，继续培养。取对数生长期的正常皮肤和SSc皮肤成纤维细胞，配成终浓度为5×l06/mL细胞悬液。转移至6孔培养板，每组设6个复孔，37℃、5%CO2浓度及100%湿度培养箱中孵育24h，待细胞贴壁后，吸出上清液，无血清DMEM培养基继续培养24h，使细胞同步化。然后分别加入20%的SSc对照组血清或各处理组含药血清（血清浓度为经预实验摸索后确定的有效浓度），正常对照组给予20%正常血清培养基继续培养。

1.3 引物设计 首先在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/的“nucleotide”中查询人各目的基因全cDNA序列；采用Primer5.0软件进行目的基因序列的上、下游引物设计，然后在http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的nucleotide blast中进行blast程序比对。最后确定的上下游引物序列见表1。

表1 CDNA上下游引物序列

引物稀释：将订购的引物EP管分别经10000r/min离心5s后加入DEPC水各200μL，然后将上下游引物混合，-20℃保存备用。Oligo dT及 MML-V 10000r/min离心5s，Oligo dT离心后加入300μL DEPC水配成50pmol/μL浓度的工作液。

1.4 SSc成纤维细胞总RNA提取 上述细胞经加入不同含药血清20%培养基培养72h后，弃去上清液，每孔分别加入消化液（0.25%胰酶和0.02%EDTA

各lmL），配成浓度为3×106/mL细胞悬液，TRIzol试剂一步法提取总RNA。

1.5 逆转录生成cDNA及PCR扩增 逆转录体系总体积为25μL，反应体系如下：总RNA 2μL、Oligo（dT）5μL、5×M-MLV Buffer4μL、dNTP（2.5mM） 6μL、Rnase Inhibitor 0.5μL、M-MLV 0.5μL， 加 ddH2O（DEPC处理）至25μL，42℃水浴箱反应 1h，再取cDNA产物与上述上、下游引物进行PCR扩增。

1.6 DNA电泳及图像分析 取上述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后以BIO-RAD凝胶成像仪紫外光下拍照，图像分析软件进行光密度分析，以β-actin作为内参照。最后以目的基因的相对转录量为参数进行半定量统计分析。实验重复3次。

1.7 统计学方法 以SPSS16.0统计软件包处理数据，计量资料以（） 表示，方差齐性检验采用Levene检验，多组均数之间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与正常皮肤比较，SSc患者皮损组织成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量明显增多（P＜0.01）；与SSc对照组比较，20%不同含药血清处理后各处理组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量明显减少（P均＜0.01）；中药组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量显著高于西药组和中西药组（P均＜0.01），中西药组显著低于西药组（P＜0.01）。各组SSc皮肤成纤维细胞MMP-1mRNA表达量明显高于正常对照组（P均＜0.01）；各组间SSc皮肤成纤维细胞MMP-1mRNA表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2，图 1～3。

表2 各组I、III型胶原及MMP-1mRNA表达量比较（，n=3）

表2 各组I、III型胶原及MMP-1mRNA表达量比较（，n=3）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与 SSc对照组比较，△P＜0.01；与西药组比较，▲P＜0.01

组 别 I型胶原 III型胶原 MMP-1 SSc对照组 0.771±0.016*▲ 0.808±0.017*▲ 0.547±0.017*西药组 0.468±0.011*△ 0.509±0.011*△ 0.523±0.014*中药组 0.686±0.013*△▲ 0.564±0.014*△▲ 0.537±0.015*中西药组 0.462±0.012*△▲ 0.219±0.009*△▲ 0.525±0.014*正常对照组 0.180±0.009△▲ 0.175±0.007△▲ 0.487±0.013

图1 各组成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA相对表达量

图2 各组成纤维细胞Ⅲ型胶原mRNA相对表达量

图3 各组成纤维细胞MMP-1mRNA相对表达量

3 讨 论

SSc 属中医“皮痹”、“血痹”、“肌痹”、“脏腑痹”等范畴。《素问·痹论》云：“痹在骨则重，在于脉则血凝不流，在于筋则屈不伸，在于肉则不仁，在于皮则寒”。《诸病源候论》谓：“风湿痹之状或皮肤顽厚……风寒湿三气杂至合而为痹，由气血虚又受风湿而成此病，久不愈入经络”。中医认为，该病因阳气不足，风寒乘虚侵袭，凝结于经络，气血凝滞，闭塞不通而发病。病机关键在于正虚、寒凝和血瘀，属本虚标实。鉴此，我们确定温阳祛瘀法，以标本兼治。温阳通络方中黄芪能“荣筋骨”，疗“贼风之病，偏中血脉，而手足不随着”（《本草汇言》）；桂枝能“开腠理，解表，去皮风湿”（《主治秘诀》），“散风寒，去肢节间风痛”（《本草汇言》），且善入血分，为温通血脉之要药；桃仁“治皮肤凝聚之血”（《本草备要》），“主血滞风痹”（《本草纲目》）；丹参能“养血，去腰脊强，脚痹”（《名医别录》），“疗风痹”（《本草经集注》）。药理研究表明，黄芪可促进T细胞的分化和成熟，扩张血管，降低血小板黏附率，减少血栓形成，抗缺氧等。桂枝能抗炎，增加冠状动脉血流量。桃仁具有改善血流变学，抗炎、抗过敏等作用。丹参能扩张冠状动脉，改善血液流变性，降低血液黏稠度，抑制凝血，抑制血小板聚集及黏附[4]。丹参还能抑制成纤维细胞的增殖和胶原合成[5-6]。因此，温阳祛瘀法治疗SSc可能以改善微循环及结缔组织代谢为主要环节，对免疫系统及内分泌起到调节性作用。

正常情况下，ECM合成与降解处于动态平衡。Jelaska等[7]证明SSc中部分皮肤成纤维细胞被激活，其I型前胶原mRNA表达明显增多。Zurita-satinas等[8]发现体外培养的SSc皮损成纤维细胞的胶原合成与正常对照组相比具有显著性差异。本研究发现，体外培养显示，SSc患者皮损组织成纤维细胞I、III型胶原mRNA表达明显多于正常皮肤，说明SSc患者成纤维细胞的胶原合成量增加，提示结缔组织的异常代谢是SSc发病机制的一个重要环节，温阳祛瘀药物在一定程度上干扰SSc患者皮肤成纤维细胞I、III型胶原mRNA的表达，而对胶原酶的干预作用不明显，其机制有待进一步深入研究。

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［7］ Jelaska A，Arakawa M，Broketa G，et al.Heterogeneity of collagen synthesis inNormal and systemic slerosis skin fibroblasts.Inereased proportion of high collagen-Producing cells in systemic selerosis fibroblasts［J］.Arthritis-Rheum，1996，39（8）：1338-1346.

［8］Zurita-Satinas CS，Richaud-Patin Y，Krotzseh-Gomez E，et al.Spontaneouscytokine gene expression by cμLtured skin fibroblast of systemic sclerosis.Correlation with collagen synthesis［J］.Revlnvest Clin，1998，50（2）：97-104.