补体C3、C4在复发性自然流产发病机制中作用的探讨

张新宇，李晶晶

(1.大连医科大学 附属第一医院 妇产科，辽宁 大连 116011； 2.河南科技大学 第一附属医院 妇产科，河南 洛阳 471003)

随着临床免疫学的发展，免疫因素在自然流产中的作用日益受到关注。本研究通过检测复发性自然流产 (recurrent spontaneous abortion，RSA) 患者血清和绒毛组织中补体C3、C4水平，以探讨补体C3、C4在RSA致病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2009年6月～2010年2月在大连医科大学附属第一医院就诊，有RSA史的患者30例为研究组。其中，15例未孕者为研究组Ⅰ，平均年龄(31.6±4.5)岁，孕次(2.9±0.8)次，就诊时间距末次流产时间均>6个月；15例就诊时诊断为难免流产者，列为研究组Ⅱ，平均年龄(30.5±4.2)岁，孕次(2.7±1.3)次，平均孕龄(61.0±11.1)d。选取同期就诊无自然流产史的女性30例为对照组。其中，15例为健康体检的已婚女性，列为对照组Ⅰ；15例为正常早期妊娠要求行人工流产者，为对照组Ⅱ。两组平均年龄、孕次及孕龄差异均无显著性意义。所有入选对象均已排除夫妻双方染色体异常、内分泌疾病、血型不合、感染、男方精液异常等因素。

1.2 实验方法

两组患者空腹时经肘静脉采血3 mL，分离出血清后置于-80℃冰箱中冻存，采用电化学发光免疫法测定血清标本补体C3、C4值；于清宫术和人工流产术中获得研究组Ⅱ和对照组Ⅱ绒毛组织，制备成石蜡切片，采用快捷型免疫组织化学法测定蜕膜和绒毛组织补体C3、C4蛋白表达，并按照阳性范围和阳性强度进行半定量评分[1]：无阳性着色的细胞为0分，阳性范围<25%为1分，26～50%为2分，51～75%为3分，>75%为4分；阳性强度弱(低倍镜下可疑阳性，高倍镜下明确阳性)为1分，阳性强度中等(低倍镜下阳性)为2分，强阳性(低倍镜下明确阳性)为3分，极强阳性(低倍镜下强阳性)为4分。将着色范围的计分与着色强度的计分相乘作为总计分，总计分0分为阴性；1～3分为弱阳性；4～9分为阳性；≥10分为强阳性。阳性范围和强度的评分相乘，即为该例的阳性积分；每组阳性积分总和除以例数，为该组阳性强度平均积分。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 血清补体C3、C4测定结果

研究组血清C3、C4值明显高于对照组(P<0.05)，见表1。研究组Ⅱ血清C3、C4值明显高于对照组Ⅱ(P<0.05)，见表2。

表1 研究组和对照组血清C3、C4测定结果

表2 各组间血清C3、C4测定结果

2.2 绒毛中补体C3、C4的表达部位

研究组Ⅱ绒毛组织可见补体C3在合体滋养细胞、细胞滋养细胞及间质细胞的细胞膜和细胞浆都有大量表达(图1)；对照组Ⅱ绒毛组织可见补体C3少量表达于合体滋养细胞、细胞滋养细胞的细胞膜和细胞浆，间质细胞无表达(图2)。

研究组Ⅱ绒毛组织补体C4在合体滋养细胞、细胞滋养细胞及间质细胞的细胞浆中都有大量表达(图3)；对照组Ⅱ绒毛组织补体C4少量表达于合体滋养细胞的细胞浆，细胞滋养细胞及间质细胞均无表达(图4)。

2.3 补体C3、C4在绒毛组织表达的半定量分析

研究组Ⅱ补体C3和 C4表达均高于对照组Ⅱ(P<0.05)，见表3、表4。

图1 研究组Ⅱ绒毛C3沉积(IHC ×400)

图2 对照组Ⅱ绒毛C3沉积(IHC ×400)

图3 研究组Ⅱ绒毛C4沉积(IHC ×400)

图4 对照组Ⅱ绒毛C4沉积(IHC ×400)

表3 补体C3在绒毛组织表达的半定量分析

Tab 3 The semiquantitative analysis result of complement C3 express in villus

表3 补体C3在绒毛组织表达的半定量分析

组别总例数强阳性阳性弱阳性阳性强度平均积分研究组II158(53.3)6(40.0) 1(6.7)10.1±4.9对照组II1505(33.3)10(66.7) 2.2±1.4

表4 补体C4在绒毛组织表达的半定量分析

Tab 4 The semiquantitative analysis result of complement C4 express in villus

表4 补体C4在绒毛组织表达的半定量分析

组别总例数强阳性阳性弱阳性阳性强度平均积分研究组Ⅱ156(40.0)4(26.7) 5(33.3)6.6±5.3对照组Ⅱ1502(13.3)13(86.7)1.7±1.0

3 讨 论

补体是存在于人体和动物血清、组织液，经活化后具有酶活性的蛋白质，在病原体微生物入侵或异体抗原存在时，补体的各成分便照一定的顺序发生酶促反应，形成放大的级联效应，称为补体激活。补体激活能直接损伤滋养细胞，补体激活后产生的裂解成分，能够使中性粒细胞和单核巨噬细胞聚集并活化，进一步对胚胎组织造成损伤[2]。补体的这种生理特性，使其在细胞免疫和体液免疫介导的胎儿损伤中发挥重要作用。在人体中C3含量最高，C4仅次于C3，C3在补体系统激活过程起着枢纽作用[3]。

3.1 补体与正常妊娠

在生理条件下，补体激活能够产生一系列补体裂解片段，这些裂解片段能够促进炎症细胞趋化，增强中性粒细胞和单核细胞的吞噬作用，使机体抵御病原体能力增强，保护正常妊娠，但是母体胎儿界面上过度的、不受调控的补体激活能够导致胎儿死亡[4]。正常妊娠妇女体内也有潜在的补体激活，但是却没有发生自然流产，这是因为体内存在一系列调节蛋白，称为补体调节蛋白(Regulator of complement activation,RCA)，RCA主要有三种：膜辅助蛋白、衰变加速因子和保护素，它们是机体为逃避补体介导的自身同源杀伤而分泌的一系列结合蛋白，能够协同调控补体转化酶的组装和稳定性，调节生理状态下的补体激活[5]。在正常妊娠状态下，胎盘不易受到补体介导的免疫损伤，其补体激活也不容易被直观的监测，因为RCA能够调节正常状态下的补体激活，使补体激活状态在短时间恢复平衡[6]。本实验发现：正常早期妊娠者血清补体C3、C4值和正常未妊娠者血清补体C3、C4值相比差异无显著性意义 (P>0.05)，说明正常妊娠状态下，补体激活处于机体可调控范围内，这可能与RCA的作用密切相关，使妊娠得以维持。

3.2 补体与复发性自然流产

有研究表明有复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)史的妇女，妊娠即将流产时，血清补体C3、C4水平较正常妊娠妇女显著升高，有学者提出补体显著升高是RSA妇女即将流产的预警器[7]，因此有学者提出在免疫因素所致的胎儿损伤中，补体机制处于中心地位[8]。Holers VM等[9]研究发现：利用C3转化酶抑制剂或应用基因技术去

除孕鼠补体C3的表达基因，能够避免孕鼠发生抗磷脂抗体介导的妊娠丢失和胎儿宫内生长受限。抗磷脂抗体通过补体经典途径激活补体系统，产生C3a、C5a等补体裂解片段，这些裂解片段能吸引炎症细胞聚集至胚胎组织，例如单核巨噬细胞、中性粒细胞。炎症细胞的聚集从而引起补体旁路途径的激活，引起补体激活级联反应，发生补体过度激活反应，同时进一步引起炎症细胞聚集，形成促炎症反应环。一些研究发现胚胎死亡的孕妇体内补体水平明显高于正常孕妇，认为这一结果导致母体血液中产生了大量的补体C3，大量的炎症细胞聚集至胚胎组织，从而导致胚胎死亡[10,11]。本研究发现：难免流产者血清补体C3、C4值显著高于正常妊娠者(P<0.05),说明难免流产者体内出现了补体水平异常情况，补体存在过度激活的可能性，与上述作者研究结果一致，由此推测补体过度激活可能是RSA的免疫学发病机制之一。

3.3 补体在绒毛组织中的表达意义

免疫学观点认为补体在组织中的表达，意味着出现了补体激活。Jaime M等[12]用免疫组织化学的方法对47例抗磷脂抗体综合征产妇和29例正常妊娠产妇的胎盘补体C3、C4沉积量进行研究：研究发现两组胎盘均有补体表达，但是前者胎盘中补体C3、C4表达量显著大于后者，补体C3表达于胎盘绒毛细胞的细胞浆中，补体C4表达于胎盘滋养细胞和基底膜的细胞浆中。Asherson RA等[11]认为RSA患者机体产生了大量的补体C3，同样也伴随着补体C3大量沉积于靶组织，胚胎组织是补体沉积的靶目标之一。本实验结果发现：难免流产绒毛组织补体C3大量表达于细胞滋养细胞、合体滋养细胞及间质细胞的细胞膜和细胞浆；补体C4大量表达于以上三种细胞的细胞浆。正常妊娠绒毛组织补体C3主要表达于细胞滋养细胞、合体滋养细胞的细胞膜和细胞浆，补体C4主要表达于合体滋养细胞的细胞浆。根据染色强度和染色范围进行半定量评分，难免流产绒毛组织中补体C3、C4表达显著高于正常妊娠绒毛组织(P<0.05)，这一结果与Jaime M等[12]研究结果基本一致。本实验亦发现正常妊娠绒毛组织也存在补体C3、C4沉积，说明正常妊娠状态下也存在一定程度的补体激活，补体激活程度在机体可调控的范围内，并没有发生大范围组织损伤，因此妊娠可

以继续。难免流产者绒毛组织补体C3、C4表达显著增高，进一步验证了此类患者体内存在补体过度激活，但是补体成分为何会沉积于这些部位，目前尚无报道，仍待后续研究。

通过以上实验推测：补体过度激活可能是RSA的免疫学发病机制之一。根据这种推测，在不远的将来，抑制补体激活的治疗方法有望为不明原因的RSA患者提供新的、更合理、更有效的治疗。

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