阿魏酸对人角质形成细胞的保护作用*

王刚，张秀华，杨金霞，常明泉，杨光义，叶方，段德鉴

(湖北医药学院附属太和医院1.药学部;2.皮肤性病研究室，湖北十堰 442000)

人角质形成细胞(human keratinocytes，HKC)在某些皮肤损伤疾病的发病机制中发挥重要作用，HKC成分不仅作为免疫佐剂参与疾病发生，而且分泌过量的趋化因子和细胞因子，促进疾病发生和维持疾病状态［1］。已有研究表明，阿魏酸对中波紫外线(ultraviolet radiation B，UVB)所致 HKC 氧化损伤具有保护作用［2-3］，但阿魏酸对氯化钴(CoCl2)诱导HKC氧化应激形成炎症损伤的保护作用及其机制笔者尚未见报道。为此，笔者参照文献［4］建立CoCl2诱导HKC氧化应激和炎症损伤体外模型，研究阿魏酸对HKC的保护作用及可能作用机制。

1 材料

1.1 试药 阿魏酸(湖北医药学院天然药化教研室提供，批号:20101026，纯度:91.72%)，HKC(湖北医药学院附属太和医院皮肤科馈赠)，CoCl2(Sigma公司)，HKC无血清培养基(keratinocyte serum free medium，K-SFM，Gibco公司)，达尔伯克改良必需基本培养基(Dulbecco’s modified minimal essential mediun，DMEM，Gibco 公司)，新生胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，杭州四季清生物制品公司，批号:100628)，人白细胞介素8酶联免疫(interleukin-8 enzyme linked immunosorbent assay，IL-8 ELISA)试剂盒，人肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA 试剂盒(R＆D System)，96 孔培养板(Corning公司)。

1.2 仪器 电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂，型号:HH.B11)，倒置显微镜(重庆光学仪器厂，型号:XDS-1B)，超净工作台［力康(Heal Force)生物医疗科技控股有限公司，型号:HF safe-1200)］，荧光显微镜(日本BX-60F3奥林巴斯)，505型酶标仪(奥地利safire多功能酶标仪)，二氧化碳(CO2)孵箱(Thermo公司)，低温高速离心机(德国贺利公司，Heraeus Germany)。

2 方法

2.1 药物溶液的配制 取一定量阿魏酸浓缩液，用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)充分溶解，加入无血清DMEM配成0.3 mg·mL-1药物溶液(以所含阿魏酸质量计)，并使DMSO终浓度＜5%。56℃消毒30 min，紫外线照射12 h，-20℃保存备用。

2.2 细胞的培养 用HKC无血清培养基10 mL和含10%FBS培养基将HKC混匀后移入40 mL培养瓶，置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养，每2～3 d换液1次，进行传代。选择生长旺盛、形态良好的细胞接种于培养皿或培养板中用于进一步实验。

2.3 药物孵育 将上述培养获得的HKC分成5组。Ⅰ组为正常对照组，在培养基上清液中加入0.9%氯化钠溶液30 μL;Ⅱ组为CoCl2对照组:上清液中加入CoCl2(终浓度2 mmol·L-1);Ⅲ～Ⅴ组为阿魏酸高、中、低剂量+CoCl2组，在上清液中分别加入阿魏酸(终浓度 0.3，0.03，0.003 mg·mL-1)和 CoCl2(终浓度2 mmol·L-1)。培养基体积均为1 mL。

2.4 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐［3-(4， 5-dimethylthiazol-2-yl)-2， 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］法检测细胞生存率 HKC孵育24 h后，向每100 μL 培养基中加入5 mg·mL-1MTT 10 μL，孵育4 h，弃培养基，每孔加入5%DMSO 1 mL，室温振荡5 min，在490 nm波长处检测各孔的吸光度值(A值)。

2.5 ELISA法检测细胞因子 分别于药物孵育24 h后收集细胞上清液，使用ELISA试剂盒，按照试剂盒说明书检测TNF-α和IL-8。

3 结果

3.1 阿魏酸对HKC生存率的影响 Ⅱ组HKC生存率为Ⅰ组的46.2%(P＜0.01);0.03和0.3 mg·mL-1阿魏酸可呈剂量依赖性地提高HKC生存率，线性回归方程为 Y=56.87X+133.06［X:阿魏酸浓度(mg·mL-1)，Y:细胞生存率］，r=0.96。见表 1。

3.2 TNF-α含量测定结果 与Ⅰ组比较，Ⅱ组TNF-α含量显著增加(P＜0.01);与Ⅱ组比较，0.03和0.3 mg·mL-1阿魏酸可抑制 HKC分泌 TNF-α(P＜0.05，P＜0.01)，0.003 mg·mL-1阿魏酸对 HKC 分泌TNF-α无明显影响，见表1。

3.3 5组细胞IL-8测定结果 与Ⅰ组比较，Ⅱ组IL-8含量显著增加(P＜0.01);与Ⅱ组比较，0.03和0.3 mg·mL-1阿魏酸可抑制HKC分泌IL-8(P＜0.05，P＜0.01)，0.003 mg·mL-1阿魏酸对 HKC 分泌 IL-6 和IL-8无明显影响，见表1。

4 讨论

CoCl2是一种常用的化学性低氧模拟剂，能诱导多种细胞产生缺氧性损伤，导致细胞存活率降低及细胞凋亡［5］。CoCl2还是一种有效的炎症反应诱导剂，可诱导氧化应激和炎症反应。ERMOLLI等［6］报道，1～2 mmol·L-1CoCl2具有损伤HKC作用，能明显降低HKC生存率，本研究结果与其研究结果吻合。此损伤作用可能与CoCl2增加活性氧生成、降低线粒体膜电位、促进细胞色素C从线粒体释放入细胞质等氧化应激反应有关。

HKC在皮肤防御外界刺激的过程中参与机体的炎症和免疫反应，炎症信号往往由HKC最先发出，HKC通过接受各种外界刺激，激活细胞内复杂的炎症信号传递机制，表达和分泌重要的炎症细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8 等［7］。由氧化应激、炎症损伤引起的皮肤损伤激活致炎细胞，导致细胞释放大量促炎症细胞因子如 TNF-α、IL-8 等。

表1 5组细胞生存率、TNF-α与IL-8含量等测定结果Tab．1 Effects of ferulic acid on the survival rate，TNF-α and IL-8 of HKC in the 5 groups

IL-8作为作用强大的中性粒细胞趋化因子，其释放的增加是导致皮肤中性粒细胞增多最主要的原因。紫外线辐射、氧化应激、病毒等均可诱导IL-8的产生。HKC能在较短的时间内通过分泌IL-8促使中性粒细胞在皮肤局部聚集，诱导后续炎症反应。因此HKC在与皮肤损伤初始阶段有关的炎症反应中起到重要的免疫调节作用。本研究结果显示，CoCl2诱导HKC的IL-8分泌量与正常HKC比较有明显差异。

本实验中，阿魏酸各剂量组HKC生存率均明显高于CoCl2对照组，证实了阿魏酸可以减轻CoCl2对HKC的氧化损伤，有提高细胞生存率的作用。ELISA检测发现阿魏酸可以抑制CoCl2氧化损伤引起的TNF-α分泌，从而初步推测，阿魏酸通过抑制CoCl2炎症损伤导致的TNF-α的分泌，保护 HKC，提高细胞生存率，此外，阿魏酸能显著抑制HKC分泌IL-8，该效应在一定范围内呈剂量依赖性［8］。本实验中，阿魏酸通过影响HKC下游炎症因子如TNF-α和IL-8分泌，从而参与调节免疫反应的信号传导机制，达到对HKC的保护作用，其具体信号调控机制有待于进一步深入研究［9］。

［1］ NOWINSKI D，KOSKELA A，KIWANUKA E，et al.Inhibition of connective tissue growth factor/CCN2 expression in human dermal fibroblasts by interleukin-1alpha and beta［J］.J Cell Biochem，2010，110(5):1226-1233.

［2］ 刘淑颖，骆丹.阿魏酸对UVB导致HKC氧化损伤的保护作用研究［J］.中国美容医学，2009，18(8):1102-1104.

［3］ 林秉奖，闵玮，骆丹.中波紫外线对HaCaT细胞凋亡、细胞周期变化及p16、c-myc蛋白表达的影响及阿魏酸干预作用研究［J］.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2010，9(1):8-11.

［4］ 林春喜，张美芬，杨春涛，等.化学性低氧模拟剂氯化钴诱导HKC炎症反应的研究［J］.中国药理学通报，2010，26(5):633-637.

［5］ JUNG J Y，MO H C，YANG K H.Inhibition by epigallocatechin gallate of CoCl2-induced apoptosis in rat PC12 cells［J］.Life Sci，2007，80(15):1355-1363.

［6］ ERMOLLI M，MENNE C，POZZI G，et al.Nickel，cobalt and chromium-induced cytotoxicity and intracellular accumulation in human hacat keratinocytes［J］.Taxicology，2001，159(1-2):23-31.

［7］ KONDO S.The roles of cytokines in photoaging［J］.J Dermatol Sci，2000，23(11):30.

［8］ 刘心霞，辛建保，曹翠珍，等.阿魏酸钠胶囊人体生物利用度与生物等效性研究［J］.医药导报，2010，29(5):600-603.

［9］ WALTER M N，WRIGHT K T，FULLER H R，et al.Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing:an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays［J］.Exp Cell Res，2010，316(7):1271-1281.