灵五颗粒保肝退黄降酶作用研究*

徐雪钰，刘军，于珊，刘青川，程丽娟，黄正明

(1.解放军第309医院药学部，北京 100091;2.解放军第302医院药剂科，北京 100039)

灵五颗粒(lingwu granules，LW)由菌草灵芝和五味子等中药配伍而成。该药在临床应用多年，具有扶正活血、疏肝利胆、保肝等功效，主治急慢性乙型肝炎、肝炎后高胆红素血症等症，疗效明显。为方便患者用药，笔者采用了现代科学技术，将其精制成颗粒剂。此前实验证实，LW对D-半乳糖胺致小鼠急性肝实质细胞损伤具有明显的保肝降酶作用［1］。由于该药还具有治疗肝炎后高胆红素血症等效果，笔者在本实验利用经典 α-萘异硫氰酸酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT)致小鼠黄疸性肝损伤模型观察LW保肝退黄降酶的作用。

1 材料

1.1 动物 昆明种小鼠，无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级，体质量 18 ～22 g，购自军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号:SCXK-(军)-2007-004。

1.2 试药 LW［解放军第302医院自制，批准文号:总L(2001)第0001号，批号:091225，规格:每袋 10 g］，茵栀黄颗粒(鲁南侯普制药有限公司，批号:0909704)，均现用现配。ANIT(解放军防化研究院第四研究所提供，批号:070512)，花生油(购自丰台华堂商场)，丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，T-BiL)试剂盒(购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，批号分别 为 110208005，100610001，20100325)，丙 二 醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(批号分别为 20100421，20100421)，谷胱甘肽(glutathione，GSH)试剂盒(批号:20100831)等均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器 85-2型恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，722光栅分光光度计(山东高密分析仪器厂)，台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，BS-120全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，病理切片机、生物显微镜(日本Olympus公司产品)，FA2004分析天平(上海天平仪器厂)。

2 方法

2.1 动物分组与给药 健康昆明种小鼠108只(分3批，每批36只)，在解放军第302医院标准(Ⅱ级)动物实验室饲养并观察2 d，然后进入实验，随机分为6组，每组6只。正常组(0.9%氯化钠溶液)，模型组，ANIT+茵栀黄颗粒组(10 g·kg-1，阳性对照组)LW高、中、低剂量组(ANIT+LW 10，5，2.5 g·kg-1)。各给药组分别按0.02 mL·g-1灌胃给药，每天1次，连续给药7 d。正常组和模型组分别灌胃给予与LW高剂量等体积的0.9%氯化钠溶液。末次给药1 h后，除正常组外，其余各组均灌胃给予0.02 mL·g-1ANIT花生油105 mg·kg-1，制备小鼠黄疸型肝损伤模型。待中毒后继续给药1 d，中毒48 h后经眼球取血并处死小鼠，取出肝脏，一部分做抗氧化指标检测，另一部分做肝病理学切片，镜检观察。

2.2 观察指标与观察方法

2.2.1 肝功能 眼球取血，将血液静置 3 h，3 000 r·min-1离心 10 min(离心半径:5 cm)，分离上层血清，全自动生化分析仪测血清ALT、AST活性及T-BiL含量。

2.2.2 肝组织氧化与抗氧化指标 剪取肝组织右叶一块，于冰盐水中漂洗，滤纸吸干，称取0.2 g，放入玻璃匀浆管中，制成10%肝组织匀浆，测定肝匀浆中MDA含量和SOD活力。

2.2.3 组织病理学 从肝右叶剪一小块组织，用10%甲醛溶液固定，固定好的肝组织由解放军第302医院病理科做组织切片，光镜下观察肝脏组织病理学变化。

3 结果

3.1 LW对黄疸型肝损伤小鼠胆红素及转氨酶的影响3批实验结果均表明，与正常组比较，模型组小鼠血清T-BiL、ALT、AST含量均明显升高。LW中、高剂量组小鼠血清T-BiL、ALT、AST含量均显著低于模型组，LW低剂量组T-BiL含量亦显著降低。LW各剂量组间肝功改善结果具有良好的量效关系(表1)。阳性对照组小鼠血清T-BiL、ALT、AST含量均显著低于模型组。

3.2 LW抗肝损伤组织氧化作用 实验结果表明，与正常组比较，模型组小鼠肝脏MDA含量显著增加，SOD活力和GSH含量显著降低。与模型组比较，LW中、高剂量组肝组织MDA含量显著降低，SOD活力显著升高，见表1。

3.3 肝组织病理学改变 光镜下，正常组肝组织结构清晰，肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉呈条索状排列，整齐有序，大小一致，细胞核大而圆，核膜清晰，汇管区肝胆管清晰可见(图1A);模型组肝细胞酸性变性，汇管区胆管上皮细胞中度肿胀、坏死，管腔重度狭窄，大量炎性细胞浸润，肝小叶结构不清(图1B);阳性对照组肝小叶结构较完整，仅见个别肝细胞嗜酸性变，汇管区胆管上皮细胞轻度肿胀、无明显坏死，另有轻度的炎性细胞浸润(图1C);LW高剂量组肝小叶结构完整，清晰可见，未见肝细胞嗜酸性变，汇管区较清晰，胆管上皮细胞可见轻微肿胀，未见坏死，管区周围有少量炎性细胞浸润，中央静脉及肝窦清晰(图1D);LW中剂量组肝小叶结构较完整，肝细胞呈轻至中度变性，坏死，炎性反应呈轻度变化，肝组织病变程度与阳性组相似(图1E);LW低剂量组肝细胞可见嗜酸性变，汇管区炎性反应较重，胆管上皮细胞可见明显肿胀，轻度管腔狭窄(图1F)。

表16 组小鼠血清ALT、AST、T-BiL、MDA、SOD和GSH测定结果Tab．1 The serum levels of ALT，AST，T-BiL，MDA，SOD and GSH in 6 groups of mice ±s

表16 组小鼠血清ALT、AST、T-BiL、MDA、SOD和GSH测定结果Tab．1 The serum levels of ALT，AST，T-BiL，MDA，SOD and GSH in 6 groups of mice ±s

ALT/(U·L-1)6) 第2批(n=6) 第3批(n=6) 抑制率/%AST/(U·L-1)第1批(n=6) 第2批(n=6) 第3批(n=6) 抑制率/%LW高剂量组 61.2±43.4*1 423.6±22.2*2 46.5±20.4*1 71.0 166.7±133.6*2 258.1±76.7*2 220.0±88.1*1 60.0中剂量组 111.6±57.3*2 144.4±42.1*2 51.4±18.5*1 57.0 231.2±89.6*2 430.0±130.9 168.3±28.5*1 49.0低剂量组 166.0±103.7*2 195.9±140.3 46.9±28.2*1 43.0 320.3±148.3 370.1±70.8 134.7±67.6*1 49.0 ANIT+茵栀黄颗粒组 169.5±36.2*1 72.2±52.8*2 115.5±59.6*1 50.0 353.3±72.6 180.0±103.6*2 312.1±157.1*1 48.0模型组 234.0±53.8 230.2±78.4 250.5±36.7 … 431.4±116.6 460.7±132.1 730.3±103.9 …正常组 7.9±1.0*1 7.8±0.3 7.1±1.4 … 33.2±3.8 30.9±4.7 33.5±4.9…

续表1 6组小鼠血清ALT、AST、T-BiL测定结果

4 讨论

笔者在本实验中采用ANIT造模后，血清 T-BiL、ALT、AST明显升高，48 h达峰值，肝病理镜检结果证实，肝实质细胞和肝内胆管损伤严重，表明造模成功，与文献报道一致［2-7］。3批重复性实验结果表明，LW组小鼠血清T-BiL、ALT、AST水平均显著低于模型组，并呈现明显的剂量依赖性，结合肝病理变化较轻等，说明LW对造成的肝损伤具有较好的保护作用，退黄降酶效果明显。与正常组比较，模型组肝脏SOD活性明显降低，MDA含量明显升高。这表明ANIT作为外源性过氧化物在肝脏转化，经氧化还原后在肝内产生多种自由基，导致组织过氧化损伤。而LW各剂量组SOD活性升高，MDA含量降低，说明LW具有一定抗氧化、减少自由基产生、减轻肝组织过氧化损伤的作用。GSH是生物体内重要的还原性物质，可作为GSH等的辅酶而参与自由基的清除，同时，GSH也具有直接清除自由基的作用，与模型组比较，LW能升高GSH的含量，表明LW可能通过增加GSH的含量而清除自由基，达到保护肝脏的作用。肝组织病理学结果显示，LW高、中剂量组与模型组比较，肝小叶结构清晰、形态完整，肝细胞变性、坏死较轻，这表明 LW对肝脏可起到较好的保护作用。

图1 6组肝组织病理学检查结果A.正常组;B.模型组;C.阳性对照组;D.LW低剂量组;E.LW中剂量组;F.LW高剂量组Fig．1 The histopathology of hepatic tissure of the 6 groupsA.normal group;B.model group;C.possitive control group;D.low-dose LW group;E.middle-dose LW group;F.high-dose LW group

总之，实验结果表明，LW可通过增强机体抗氧化能力，加速自由基清除，修复受损肝细胞，从而达到对ANIT所造成肝损伤的保护作用，使肝功能得到改善。

［1］ 徐雪钰，于珊，胡克章，等.灵五颗粒对D-半乳糖胺盐酸盐致小鼠肝损伤的保护作用［J］.解放军药学学报，2010，26(5):426-427.

［2］ 方厚华.医学实验动物模型［M］.北京:军事医学科学院出版社，2001:325.

［3］ 黄正明，杨新波，曹文斌，等.水芹退黄降酶疗效的实验研究［J］.中国药学杂志，1989，24(2):84-85.

［4］ JEAN P A，ROTH R A.Naphthylisothiocyanate disposition in bile and its relationship to liver glutathione and toxicity［J］.Biochem Pharmacol，1995，50(9):1469-1474.

［5］ DAHM L J，SCHULTZE A E，ROTH R A.An antibody to neutrophils attenuates alpha-naphthylisothiocyanate-induced liver injury［J］.J Pharmacol Exp Ther，1991，256:412-420.

［6］ 杨新波，黄正明，曹文斌，等.CCl4、D-Gal、ANIT 对化学性肝损伤小鼠血清生化指标的影响［J］.世界华人消化杂志，1998，6(1):19.

［7］ 黄正明，杨新波，曹文斌，等.化学性及免疫性肝损伤模型的方法学研究［J］.解放军药学学报，2005，21(1):42-46.