基因表达差异对牛胚胎发育潜能的影响*

毋状元,孙美玉,海里且木,郑新宝,董 红,霍 飞,陈静波*

(1.石河子大学动物科技学院,新疆石河子 832003;2.新疆畜牧科学院畜牧研究所,新疆乌鲁木齐 830000)

基因表达差异对牛胚胎发育潜能的影响*

毋状元1,孙美玉2,海里且木2,郑新宝2,董 红2,霍 飞2,陈静波2*

(1.石河子大学动物科技学院,新疆石河子 832003;2.新疆畜牧科学院畜牧研究所,新疆乌鲁木齐 830000)

随着牛胚胎体外生产(IVP)技术的不断成熟,体外胚胎生产在一些国家已进入商业化运营阶段。但与体内胚胎相比其移植受体妊娠率、产犊率及胎儿的后天发育能力均较差。因此,开发一种既可靠又实用的检测胚胎发育潜能的技术显得尤为重要。应用实时荧光定量PCR技术检测早期胚胎基因表达,通过分析mRNA的表达丰度来评价卵母细胞成熟情况和胚胎质量是一种可行的方法。论文综述了国内外有关牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中部分基因mRNA表达状况,分析了基因表达与胚胎潜能的关系。

基因表达;实时荧光定量PCR;胚胎发育潜能;牛

在牛胚胎体外生产及胚胎移植工作中,尽管胚胎移植受体妊娠率、胎儿出生率及胎儿的健康状况是胚胎质量评价的重要标准,但对这3项指标进行评价极其困难。开发一种即可靠又实用的检测胚胎发育潜能的技术就显得尤为重要,即准确地评估体外生产胚胎的发育能力是确保体外胚胎移植妊娠率和产犊率的关键。一般而言,胚胎形态学标准通常被作为评估胚胎质量和发育潜能的标准。形态学评价标准包括卵丘卵母细胞复合体分级评价(cumulus-oocyte complex,COCs)、原核期评分、早期胚胎评分、囊胚期胚胎评分和胚胎代谢评定。在这一评价体系中,认为具有致密、多层颗粒细胞和均一胞质的COCs是质量较高的卵母细胞;具有 2个原核(pronucleus,PN)、2个极体、规则的形态、完整的透明带,胞质边缘有清楚的胞质晕是正常受精的表现;早期胚胎中碎片较少且较集中,卵裂球大小均一透明;囊胚的孵化程度较高,内细胞团细胞数目多包裹紧密,滋养层细胞排列紧密被视为具有较强发育潜能的胚胎;具有最高营养消耗率/铵产量的胚泡植入可能性最大[1]。此外,罗学明等[2]研究认为初次卵裂时间是猪克隆胚胎发育潜能的重要标识;唐志霞等[3]研究表明异常线粒体数量的增加、线粒体的异常分布及卵裂球之间线粒体的不均匀分布导致补救单精子注射(intrcytoplsmic sperminjection ICSI)后胚胎发育潜能低下;黄晓洁等[4]研究显示,与程序冷冻相比玻璃化冷冻更好的保存了胚胎的发育潜能;蒲艳等[5]应用偏振光显微镜分析了人卵透明带与胚胎发育潜能的关系发现,优质胚胎组卵子全层透明带厚度显著低于劣质胚胎;妊娠组卵子内层透明带和全层透明带均低于未妊娠组 。

但生产实践中相似形态学特征的体内和体外胚在移植妊娠率、出生率及胎儿发育能力上均存在较大差异[6]。甚至有些从形态学上看具有较好发育潜力的胚胎反而在移植后发育上不如形态较差的胚胎,如苏建民[7]研究发现有时具有较好致密化和囊胚扩张性的克隆胚胎,在移植后维持妊娠的能力上还不如形态学标准较差的胚胎。因此,仅依靠形态学标准评估胚胎质量远远不能满足胚胎发育潜能评估的要求。

附植前胚胎发育包括第一次卵裂,胚胎基因组激活、致密化、桑葚胚和囊胚。此过程需要母源基因和合子(胚胎)基因很好的协调表达。合子基因组激活之前,卵母细胞成熟过程中积累的母源mRNA和已合成的蛋白质共同指导了胚胎的早期发育。而此时恰是胚胎发育最敏感的时期,Rivera R M等[8]研究提示各种体外操作即使是最简单的胚胎移植都会对胚胎印记基因的甲基化及基因表达产生一定程度的影响。牛胚胎基因表达谱分析研究发现,人工受精获得的胚胎和体外生产的胚胎在基因表达丰度上存在很大差异[9]。王增艳[10]研究结果提示小鼠胚胎的玻璃化冷冻复苏过程会加重体外授精等操作引起的植入后胎鼠基因组DNA中H19/Igf2 DMD的甲基化丢失,而对H 19/Igf2 DMD基因表达量影响不大,但会加重体外授精等操作引起的H19基因表达减少。胚胎体外操作过程干扰了基因的重编程,最终影响胚胎的发育潜能。因此,通过分子生物学的方法筛选出那些较易受干扰的基因,通过检测其表达量的变化来判断胚胎发育潜能是胚胎工程研究的热点之一。

1 卵子和胚胎中mRNA表达分析

要弄清卵母细胞成熟和胚胎早期发育的分子机制,首先要鉴定差异表达基因。RT-PCR技术使得我们可以研究在单个卵子和单个胚胎中个别基因的表达情况。采用数据的标准需根据加入的细胞数量、不同RNA含量及酶活性来矫正RT-PCR参数。通常用一个管家基因作为内参。内参基因必须保证在不同条件下和不同扩增体系中稳定表达。早期胚胎发育过程中基因的表达是处在变化之中(包括管家基因)。因此,当管家基因表达不稳定时,目的基因再与其进行标准化对比时就有可能引起很大偏差。所以,内源性的管家基因和外源性mRNA应该共同被作为参照。

2 基因表达差异对卵母细胞发育潜能的影响

通常从屠宰动物卵巢上收集的直径为2 mm～8 mm卵泡的COCs用于体外胚胎生产。这些卵泡一般需要经过数天后才能发育到排卵前的大小,所以此时的卵泡因为尚未能产生足够的激素和生长因子而使卵母细胞没有积累足够的母源mRNA,进而不能在体外完成发育。卵母细胞自身的发育受一系列基因表达的控制,这些基因使卵母细胞和细胞质成熟。卵母细胞的发育潜能是卵母细胞质成熟的反映,而且核成熟的卵母细胞因其胞质成熟程度不同而形成的胚胎发育能力也不同。卵母细胞的发育能力也决定了卵母细胞的受精、卵裂和随后的胚胎发育情况。另外,卵母细胞的发育潜能是在在卵泡的发育过程中形成的,腔前卵泡的卵母细胞不能完成第一次减数分裂,而来自有腔卵泡的卵母细胞能够完成第一次减数分裂,来自更大腔前卵泡的卵母细胞发育能力更强。

卵母细胞在生长期进行转录和mRNA的储存。牛的卵泡生长到大约3 mm时逐步成熟,此时累积在卵子中的转录产物,母源mRNA和蛋白质指导卵母细胞成熟、受精、早期卵裂、直至胚胎基因组的激活。mRNA的储存发生于卵子的成长过程中,转录过程中形成的3′poly(A)末端是一个重要的调节元件,此元件保证mRNA的稳定性。有研究表明转录产物大多数表现出延迟脱腺苷化作用,有一个短的3′poly(A)末端的转录产物的卵母细胞往往发育能力较低,这一事实暗示脱腺苷化作用和腺苷化作用在牛卵母细胞体外成熟中起重要作用[11]。

许多研究工作已经从分子水平探索了牛卵母细胞的发育能力。这些研究工作分析了体外成熟卵母细胞[12-13]和囊胚[14]的转录丰度,研究表明无论培养液中是否添加FSH和颗粒细胞,目的基因的相对丰度没有变化。然而,添加血清的培养液几乎降低了所有目的基因的表达量[15]。通常,不同直径大小卵泡中的卵母细胞基因表达有差异,这一现象暗示卵母细胞成熟状态和卵母细胞起始培养的时间与其最终的发育能力关系密切[16]。牛每个情期有2个～3个卵泡波,在这期间,有卵泡的生长、停滞、优势化和闭锁。在每一轮卵泡波中有一批卵泡开始生长直至3 min～4 mm。研究表明从生长期和停滞期之间的卵泡中获得的卵母细胞比从停滞期和优势期卵泡中获得的卵母细胞有更好的发育潜能,其囊胚中CX43基因的表达量也高于后者[17]。

从幼年母畜获得的卵母细胞成功发育到囊胚的比率远小于从成年母畜获得的卵母细胞,这可归因于葡萄糖转运蛋白的表达缺陷和蛋白质翻译的不足且这种缺陷可通过在卵巢内补充IGF-1的到部分的解决[18]。研究表明,持续性卵泡可导致与胚胎发育密切相关基因在胚胎发育过程中表达丰度的改变,并且可能危害到牛早期胚胎的发育[19]。因此分析卵母细胞成熟过程中基因的mRNA的表达有助于找出牛卵母细胞发育能力的控制基因。

3 胚胎发育潜能相关基因

有很多学者对牛早期胚胎发育过程中mRNA表达模式进行了研究。在桑葚胚和囊胚期用 IVP和其他的技术如体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,scNT),已确定与发育密切相关基因转录的影响。体外环境和核移植程序对移植前牛胚胎期mRNA的表达有很大影响[6]。在过去10年～15年体外培养系统有了很大改进,如今,绝大多数的培养系统是已知成分和半已知成分的。然而这些培养系统还是不能完全模拟体内环境。近期已发表了很多的在体内外scNT生产胚胎差异表达基因(表3)。通过与体外生产相比较,在羊的输卵管中培养可获得更高质量的的囊胚。这样生产的胚胎候选基因与完全体内生产的胚胎有相似的基因表达水平[27]。

表1 不同来源、不同生理指标和不同培养条件对牛囊胚mRNA表达丰度的影响Table 1 Effects of the different origin,different physidogic index and different culture condition on messenger RNA abundance in bovine blastocysts

4 小结

mRNA表达检测和其他定量参数得的结合将有可能对可用胚胎的选择提供指标。需要在模式动物和试验动物体上做分子检测,这对于进一步研究胚胎和胎儿基因的表达模式是一个很好的方向。了解胚胎发育分子机制对于改善生物技术应用将有很大帮助。

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Effect of Gene Expression on Developmental Potential of Bovine Embryos

WU Zhuang-yuan1,SUN Mei-yu2,HAI LI Qie-mu2,ZHENG Xin-bao2,DONG Hong2,HUO Fei2,CHEN Jing-bo2

(1.College of Animal Science&Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinj iang,832003,China;2.Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi,Xinjiang,830000,China)

With the development of production of bovine embryos(IVP)technology,thein vitroproducted embryo has reached commercial operation stage in some countries.However,compared within vivoproducted embryo,the pregnancy rate of its transplant recipients,calving rate and fetal development capabilities acquired are poorer.Therefore,it is essential to develop reliable and practical test systems for the quality evaluation of embryos.Real-time fluorescence quantitative PCR applying to the expression of early embryonic gene and then analyzing the expression of abundance of mRNA to evaluate oocyte maturation and the quality of embryo have been proven to be a feasible method.This paper reviewed expressions of both maturation of bovine oocytes and that of partial genes of mRNA in early embryonic development and discussed the relationship between the expression of gene and the potential of embryo.

gene expression;real-time fluorescence quantitative PCR;developmental potential of embryo;bovine

S814.8;Q786

A

1007-5038(2011)07-0085-04

2011-01-26

国家自然科学基金项目(30760167)

毋状元(1984-),男,陕西韩城人,硕士研究生,主要从事动物繁殖学研究。*通讯作者