一株广东鸽新城疫病毒的生物学特性分析*

何 琴,焦培荣,刘大伟,韦娜娜,龚 军,廖 明,任 涛

(华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室及广东省动物源性人畜共患病预防与控制重点实验室,广东广州 510642)

一株广东鸽新城疫病毒的生物学特性分析*

何 琴,焦培荣*,刘大伟,韦娜娜,龚 军,廖 明,任 涛*

(华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室及广东省动物源性人畜共患病预防与控制重点实验室,广东广州 510642)

为了解广东地区鸽新城疫病毒的生物学特性,对广东分离株SD54进行了鸡胚平均死亡时间(MDT)、6周龄鸡静脉接种的致病指数(IVPI)、1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)的测定,并对该毒株F基因的重要功能区片段进行RT-PCR扩增、测序,利用MEGA 4软件绘制系统进化树。经测定,分离株SD54的MDT为 60 h、IVPI为2.49、ICPI为1.6;其F基因裂解位点的氨基酸序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒株F基因裂解位点氨基酸序列的特征;系统进化树表明该毒株属于基因Ⅶ,与广西鸽源株Gxp40处于同一细分支,同源性最近,表明该分离株SD54为基因Ⅶ强毒株。

鸽;新城疫病毒;基因Ⅶ型

*通讯作者

鸽新城疫俗称鸽瘟,是由鸽I型副黏病毒(Pigeon paramyxovirus 1,PPMV-Ⅰ)引起的一种高度接触性急性传染病,以肠炎、严重腹泻和神经症状为特征,是危害养鸽业的重要疫病之一,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的疫病。PPMV-I属于副黏病毒科(Paramy xoviridae)、禽病毒属(Avianvirus),为单链负股 RNA病毒,其基因组长度约为 15 kb。PPMV-I由 NP、P 、M 、F、HN 、L 6 种病毒特异性结构蛋白组成。有研究表明,F基因和HN基因与禽副黏病毒的变异有直接关系,使得新的基因型不断出现,其中F基因是决定毒力的主要基因,它所编码的融合蛋白在病毒对细胞的穿透、溶血及细胞与细胞之间的融合方面起主要作用[1-2]。与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)一样,PPMV-I只有一个血清型,但是不同毒株的毒力却表现出很大的差异。

该病于1981年首次在苏丹和埃及的信鸽中发现,随后迅速传播到欧洲、美国、加拿大等地[3-6],1985年传入我国香港,同年8月珠海拱北动物检疫局从台湾引进的种鸽中分离到该病毒[7]。目前,我国大部分地方已有本病的报道,给我国的养鸽业造成了巨大的经济损失。本研究对广东顺德地区发病鸽群中分离到的一株鸽瘟病毒进行了致病指数测定及F基因扩增,绘制F基因的系统进化树,并对F蛋白裂解位点氨基酸序列进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究中使用的鸽新城疫病毒SD54株分离自广东顺德,由华南农业大学兽医学院传染教研室及农业部动物疫病防控重点开放实验室分离鉴定和保存,用于分析比较的其他毒株的资料详见表1。TRIzol、pMD18T 、RT-PCR 试剂 盒(One Step RNA PCR Kit)为宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病毒致病指数测定 采用OIE规定的方法[8]测定其致病指数,包括鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)、6周龄鸡静脉接种的致病指数(IVPI)。

1.2.2 病毒F基因序列测定

1.2.2.1 设计引物 依据GenBank上公布的NDV基因序列,针对F基因核苷酸序列的保守区域运用Oligo 6.0引物设计软件设计引物,扩增大小为450 bp,包含编码F蛋白裂解位点。上下游引物为:NDV-FF:5＇-CAA AT T AGA AAA AAC ACG-3＇;NDV-FR:5＇-GCA ACC CCA AGC GC-3＇,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2.2 RNA抽提及RT-PCR 按照TaKaRa的TRIzol试剂说明书提取SD54株的病毒RNA,加入适量的DEPC处理水溶解。RT-PCR扩增参照TaKaRa的RT-PCR试剂盒(One Step RNA PCR Kit)说明书进行。

1.2.2.3 F基因序列测定和序列分析 将PCR产物经胶回收纯化后与pMD18T载体连接,连接产物转化至DH5α感受态细胞,经鉴定的阳性重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。利用MEGA 4软件按照文献[9]方法选取F基因3＇末端374个核苷酸片段对SD54株与GenBank中发表的有代表性的新城疫毒株进行基因分型(表1);利用DNA Star(Version 7.1)分析其F蛋白裂解位点氨基酸序列,并对表1中的20株毒株及La Sota疫苗株进行核苷酸及氨基酸序列分析。

表1 研究所用的基因VII的毒株Table 1 Geoty pe VII of NDV isolates analyzed in this study

2 结果

2.1 病毒致病指数测定

SD54株的致病指数 MDT、IVPI、ICPI分别为2.49、1.6和60,表明该毒株为新城疫强毒株。

2.2 F蛋白裂解位点的分析及推导氨基酸序列同源性分析

SD54株F蛋白裂解位点区(112～117)的氨基酸序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒株F蛋白裂解位点氨基酸序列特征。将SD54株的F基因的核苷酸序列与表1中的NDV以及我国常用的La Sota疫苗株进行同源性比较,结果表明SD54株与其他基因VII毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别为91.1%～98.1%和89.5%～97.6%,而与La Sota疫苗株的核苷酸和氨基酸的同源性只有80.1%和78.2%。

2.3 F基因进化分析

从GenBank上选择42株NDV F基因核苷酸序列与SD54株进行系统进化树绘制与分析,结果见图1。

系统发育分析结果显示,本研究中的SD54株与大部分的国内NDV均属于基因Ⅶ型,且与CH/Gxp40/PG株处于同一细分支上,亲缘关系最近(图.1)。基因Ⅶ型的NDV毒株可分成三个进化分支,而与本研究分离株处于同一进化分支的有CH/ZJ1/00/GO、CH/SF/02/GO、CH/YNPA/01/CK、CH/YN-C2/CK、CH/JS-5/01/GO、CH//JS/03/GO、CH/SD5/04/GO、CH/JS/Y98/FW、CH//Gxp40/PG、CH/XJ/97/CK、CH/TW-10/06/CK、CH/TW2000/CK、CH/TW/99-173/CK。

图1 F基因系统进化树Fig.1 Phylogeny tree of F gene

3 讨论

目前,在全球范围内经历过3次NDV的大流行,而第3次大流行则是由基因Ⅵ型的鸽I型副黏病毒引起的[10-11]。20世纪90年代以来,虽然没有出现世界性ND大流行,但局部地区的流行和暴发时有发生(如中国台湾、西欧、南非、中国等地)[12-16],主要为基因Ⅶ。近年来我国鸽I型副黏病毒所包含的基因型大致有3种,即Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ型[17-19]。从系统进化树上看,本研究中的SD54株与广西株Gxp 40处于同一细分支,同源性最近,均属于基因Ⅶ型,与近年来新城疫流行的基因型相符合。

F蛋白在NDV的致病性上发挥着重要作用。F蛋白的合成先以无活性的F0存在,F0经蛋白酶裂解为F1和F2两个亚单位后,发挥其融合活性,使病毒具有感染力[1]。F蛋白能否被裂解取决于F蛋白裂解位点区(112～117)处氨基酸组成和宿主细胞的特性。NDV毒力的强弱一般可以根据病毒的致病指数及F蛋白裂解位点氨基酸序列进行判断。强毒株的F蛋白裂解位点处的氨基酸序列为112R/K-R-QR/K-R116,且117位的氨基酸为苯丙氨酸[20]。本研究中 SD54株 MDT、IVPI、ICPI分别为 60 h、2.49、1.6,且F蛋白F裂解解位点氨基酸序列为112 RRQKRF 117,两者均符合NDV强毒判定标准。

本研究对F基因进行推导氨基酸序列同源性分析,发现SD株与基因Ⅶ其他毒株的核苷酸和氨基酸同源性均较高,但与La Sota疫苗株的核苷酸和氨基酸的同源性较低。目前尚无鸽NDV专用的疫苗,主要应用LaSota等鸡用疫苗进行免疫,这可能是免疫效果不理想的原因之一。

综上所述,本研究中广东分离株为基因Ⅶ型强毒株,且与La Sota疫苗株同源性较低,遗传距离较远。由于鸽是NDV的主要宿主及携带者,其活动范围较大,是疫病传播的一个重要隐患。因此,弄清鸽Ⅰ型副黏病毒的流行情况和遗传进化特点,研制有效的鸽专用的鸽瘟疫苗,制定科学的防控措施,对控制该病及鸡新城疫的流行具有重要意义。

[1]殷 震,刘景华.动物病毒学[M].2版,北京:科学技术出版社,1997:739-741.

[2]刘华雷,王永坤,严维巍,等.禽副粘病毒Ⅰ型(APMV-1)分子生物学研究进展[J].动物医学进展,2001,22(1):16-20.

[3]Alexander D J.Avian paramy xoviridae-recent developments[J].Vet Microbiol,1990,23(1-4):103-114.

[4]Alexander D J,Russell P H,Parsons G,et al.Antigenic and biological characterization of avian paramyxovirus type 1 isolates from pigeon an international collaborative study[J].Avian pathol,1985,14(3):365-376.

[5]Alexander D J,Russell P H,Collins M S.Paramyx ovirus type 1 infections of racing pigeon:characterisation of isolated viruses[J].Vet Rec,1984,114(18):444-446.

[6]Eisa M,Omer E A.A natural outbreak of Newcastle disease in pigeons in the Sudan[J].Vet Rec,1984,114(12):297.

[7]梁荣赞,王林川,游 洪,等.鸽Ⅰ型副黏病毒病的发病特点与综合特征[J].中国兽医科技,1998,28(5):31-32.

[8]世界动物卫生组织.诊断试验和疫苗标准手册[M].北京:中国农业科学技术出版社,2004:140-146.

[9]Liu X F,Wan H Q,Ni X X,et al.Pathotypica and genotypica characterization of strains of Newcastle disease virus isolated from outbreaks in chicken and goose in some regions of China during 1985-2001[J].Arch Virol,2003,148(7):1387-1403.

[10]Czegledi A,Herczeg J,Hadjiev G,et al.The occurrence of five major Newcastle disease virus genotypes(II,IV,V,VI and VIIb)in Bulgaria between 1959 and 1996[J].Epidemiol Infect,2002,129(3):679-688.

[11]Herczeg J,Pascucci S,Massi P,et al.A longitudinal study of velogenic Newcastle disease virus genotypes isolated in Italy between 1960 and 2000[J].Avian Pathol,2001,30(2):163-168.

[12]Liang R,Cao D J,Li J Q,et al.Newcastle disease outbreaks in western China were caused by the genotypes VIIa and VIII[J].Vet Microbiol,2002,87(3):193-203.

[13]Lien Y Y,Lee J W,Su H Y,et al.Phylogenetic characterization of Newcastle disease viruses isolated in Taiwan during 2003-2006[J].Vet Microbiol,2007,123(1-3):194-202.

[14]Liu H,Wang Z,Wu Y,et al.M olecular epidemiological analysis of Newcastle disease virus isolated in China in 2005[J].J Virol Methods,2007,140(1-2):206-211.

[15]Yu L,Wang Z,Jiang Y,et al.Characterization of newly emerging Newcastle disease virus isolates from the People＇s Republic of China and T aiwan[J].J Clin Microbiol,2001,39(10):3512-3519.

[16]任 涛,敖艳华,曹伟胜,等.我国部分地区近年来新城疫病毒流行株分子生物学特征的研究[J].华南农业大学学报,2006,27(3):89-92.

[17]Herczeg J,Wehmann E,Bragg R R,et al.Two novel genetic groups(VIIb and VIII)responsible for recent Newcastle disease outbreaks in Southern Europe[J].A rch Virol,1999,144(11):2087-2099.

[18]Lomniczi B,Wehmann E,Herczeg J,et al.Newcastle disease outbreaks in recent years in Western Europe were caused by a(VI)and a novel genotype(VIII)[J].Arch Virol,1998,143(1):49-64.

[19]邹永新,李少方,廖新权,等.广东鸽禽型副粘病毒基因型的分离鉴定[J].养禽与禽病防治,2009(8):40-43.

[20]OIE.M anual of diag nostic tests and vaccines for terrestrial animals:mammals,birds and bees[R].In:Biological Standards Commission:World Organization for Animal Health Paris,2009:576-589.

Characterization of Pigeon Newcastle Disease Virus Isolated from Guangdong

HE Qin,JIAO Pei-rong,LIU Da-wei,GONG Jun,WEI Na-na,LIAO Ming,REN Tao

(K ey Lab of Animal Disease Control and Prevention of Ministry of Agriculture,K ey Lab of Zoonoses Control and Prevention of Guangdong,College of veterinary medicine,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

The characteristics of a pigeon Newcastle disease virus strain isolated from Guangdong were studied.Pathogenicity indexes,such as the mean death time(MDT),intravenous pathogenicity index(IVPI)and intracerebral pathogenicity index(ICPI)were 60 h,2.49 and 1.6,respectively.The important functional fragment fo F gene was amplified by reverse transcription(RT)-polymerase chain reaction(PCR)and sequenced.The motif of its cleavage site was 112RRQKRF117,which was consistent with that of velogenic strains of NDV.Phylogenetic analysis of the isolate revealed that it was clustered into genotypeⅦand has a closer relationship to pigeon NDV strain Gxp40 isolated in Guangxi.

pigeon;Newcastle disease virus;genotypeⅦ

S852.659.5

A

1007-5038(2011)09-0023-04

2011-01-17

公益性行业专项项目(200803020-08);国家自然科学基金项目(31072319)

何 琴(1986-),女,湖南衡阳人,硕士研究生,主要从事动物病毒分子生物学研究。