TRAIL联合顺铂诱导骨肉瘤 HOS-8603细胞凋亡研究

周志刚 廖建平 傅江明 李强 严朝华 蔡亮

骨肉瘤是一种相对耐药的肿瘤，单药化疗的效果一直不很理想。联合化疗多以铂类药物为主。TRAIL是INF超家族成员，能选择性杀伤肿瘤细胞。本实验旨在探讨TRAIL与铂类药物联合化疗方案的可行性，为骨肉瘤的临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 实验材料 HOS-8603细胞株购自中国医学科学院药物研究所;TRAIL、顺铂、CsA均购自Sigma公司(化学纯标准品)。主要器材:流式细胞仪 型号:EPICS ALTRAⅡ.American Beckman;荧光酶标仪 型号:GENIOS VA200，AUSTRIA TECAN。

1.2 药物配制 将TRAIL用生理盐水溶解并分别配制成10ug/ml和50ug/ml两种浓度的储藏液。将顺铂、CsA分别用生理盐配制成10ug/ml的储藏液，备用。

1.3 凋亡细胞荧光染色 HOS-8603细胞以1×106接种于六孔板培养，加入不同浓度的TRAIL+顺铂，培养24 h后，经DHanks液洗涤及荧光染料Hoechst33258和PI，37℃避光染色10 min，洗涤后在荧光显微镜下观察细胞形态及颜色改变。

1.4 透射电镜观察 1000 r/min，离心10 min收集处理后的HOS-8603细胞，经固定、脱水、包被及乙酸双氧铀和枸橼酸铅双染色处理后透射电镜观察细胞形态。

1.5 MTT法测定TRAIL，顺铂，TRAIL+顺铂对HOS-8603细胞生长的影响 取对数生长期HOS-8603细胞，以2×106/ml的细胞浓度，接种于上述三种药物处理培养基中，以生理盐水为空白对照组。将每种药物组分两组，其中一组在加药物前30 min加入终浓度1.0 μg/mlCsA［10，11］，每组设 3 个平行对照孔。

1.6 细胞DNA含量分布测定 取药物处理12，24，36，48 h后HOS-8603细胞，经固定、染色后流式细胞仪测定DNA。

1.7 细胞ΔΨm检测 参照文献［1，2］，取上述三种药物处理12，24，36，48 h后的HOS-8603细胞，经DHanks液洗涤后用10ug/ml Rh123在37℃避光染色30 min，再次洗涤后用10ug/ml PI在37℃避光染色20 min，流式细胞仪检测。

1.8 统计学方法 用SPSS统计软件包作方差分析对各组作显著性检验，TRAIL组与TRAIL加CsA组采用配对t检验，以P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 HOS-8603细胞分别经2.5 ug/ml TRAIL，1.0 ug/ml顺铂，2.5μg/ml TRAIL+1.0μg/ml顺铂作用后，都出现了明显的凋亡峰，亚G1期细胞百分率分别为29.3%，57%，83%。联合用药组明显高于单一用药组(P＜0.01)。

2.2 在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密颗粒块状荧光。如图1示。

图1 比较两图中的同一细胞高蓝/低红为凋亡细胞;低蓝/高红为坏死细胞;低蓝/低红为正常细胞。

2.3 HOS-8603细胞经2.5ug/ml TRAIL+1.0 ug/ml顺铂作用12 h后，倒置显微镜下见细胞体积缩小，开始呈圆形，以细胞表面起泡，变成不规则形状。紧邻细胞之间出现空虚，有离群，脱落感。透射电镜下见凋亡细胞核内染色质的浓缩，形成染色质块，并集聚在核的边缘，呈半月形，花瓣状基底部紧贴核膜。胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体，其外有完整的膜封闭，其内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体;线粒体肿胀，空泡状，外膜破裂，内膜胀大呈气球状，脊消失。如图3所示。

图2 A 染色质浓缩，形成染色质块，并边聚在核的边缘，呈半月形，花瓣状，基底部紧贴核膜。

图2 B 线粒体肿胀，空泡化，内膜肿大呈气球状，脊消失。胞质间可见早期凋亡小体。

2.4 经TRAIL+顺铂和TRAIL+顺铂+CsA处理后的细胞ΔΨm变化如表2所示;TRAIL+顺铂组的Rh123-PI-细胞百分率均明显高于空白对照组(P＜0.01)。表明在胞膜完整的情况下，TRAIL+顺铂能引起ΔΨm下降(P＜0.01);TRAIL+顺铂作用前加入CsA后，Rh123-PI-细胞百分率明显降低(P＜0.01)，但仍高于空白对照组(P＜0.01)。

2.5 TRAIL+顺铂作用于HOS-8603细胞后Rh123-PI-与亚G1期细胞百分率间有直线相关关系(r=0.998，P＜0.01)，即凋亡细胞百分率越高，ΔΨm下降细胞百分率越高。

3 讨论

联合化疗是目前提高骨肉瘤细胞对化疗的敏感性的研究热点。本研究中TRAIL+顺铂的MTT法测定抑制率为58.5%。明显优于两者单用(P＜0.01)，说明在骨肉瘤化疗中顺铂和TRAIL有协同作用，能增强骨肉瘤对化疗的敏感性，并且顺铂的使用剂量明显减少。

亚G1期细胞出现是细胞凋亡的标志之一。本研究中我们采用了TRAIL、顺铂，TRAIL+顺铂分别作用于HOS-8603细胞后测定亚G1期细胞百分率，结果显示TRAIL+顺铂组诱导细胞凋亡的作用显著高于TRAIL组和顺铂组(P＜0.01)。表明TRAIL+顺铂的联合化疗方案可能提高骨肉瘤细胞对化疗的敏感性。

近年来研究证实，线粒体在细胞凋亡控制中起决定性作用［3，4］线粒体的早期改变为:线粒体膜通透性转运孔(MPTP)开放，释放线粒体内凋亡相关物质，这些物质激活Caspase-9酶系，从而引发连锁反应而诱导细胞凋亡。MPTP是跨膜多蛋白孔，可能由电压依赖的阴离子通道(VDAC)-腺苷酸移位酶-亲环蛋白-D(CyP-D)三联复合物构成［5-8］。在正常情况下MPTP只允许质子等分子量较小的物质通过线粒体膜，形成稳定ΔΨm。MPTP开放可导致ΔΨm下降或丧失，因此，可通过检测ΔΨm观察线粒体的改变［9-11］。本研究中我们发现经TRAIL和顺铂处理后的HOS-8603细胞ΔΨm随药物作用时间的增加而下降，并且与线粒体超微结构改变相一致。

顺铂和TRAIL联合化疗既增强骨肉瘤细胞对其化疗的敏感性，又减少了顺铂的使用剂量。我们相信TRAIL和顺铂的联合化疗方案会有很广阔的临床应用前景。由于体外细胞株培养不能模仿体内三维结构，不能准确反映药物-人体-肿瘤的复杂关系，且肿瘤具有一定的异质性。因此只能从实验的角度来肯定联合应用顺铂和TRAIL，能取得比单独应用顺铂或TRAIL更明显的对骨肉瘤细胞株的细胞毒性作用，为临床应用提供了实验依据，但进一步的结果尚需更深入的研究。

［1］ Griffith TS，Chin WA，Jackson GC，et al.Intracellular regulation of TRAIL-induced apoptosis in human melanoma cells.J Immunol，1998，161:2833-2840．

［2］ 祝少博，陈振光，喻爱喜，方成．人可溶性蛋白诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究．中华骨科杂志，2003，23(6)．

［3］ 李宁丽，路丽明，沈佰华，等．重组人可溶性．The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL.Science，1997，276:111-113．

［4］ TRAIL分子诱导细胞凋亡机理探讨．上海第二医科大学学报，2003，23(1)．

［5］ 范清林，宋礼华，魏伟．的诱导肿瘤细胞凋亡与临床．中国药理学通报，2003，19(9):976-981．

［6］ Halestrap AP，Doran E，Gllespie JP，et al.Mitochondrial and cell death.Biochemi Soci Transac，2000，28:170-177．

［7］ Larochette N，Decaudin D，Jacotot E，et al.Arsenite induces apoptosis via a direct effect on the mitochondrial permeability transition pore.ExpcellRes，1999，249:413-421．

［8］ Gajate C，Antonio MS，Machoa，et al.Involvment of mitochondrial and caspase-3 in ET-18-OCH3-induced apoptosis of human leukemic cells.Inter J Cancer，2000，86:208-218．

［9］ 沈玉雷，陈国强，蔡循，等．谷胱甘肽合成酶抑制剂加强三氧化二砷的凋亡诱导效应．中华肿瘤杂志，1999，21:259-261．

［10］ Crompton M．The mitochondria permeability transition pore and its role in cell death.Biochom J，1999，341:233-249．

［11］ Shimizu S，Konishi A，Kodama T，et al.BH4 domain of antiapoptotic Bcl-2 family members loses voltage-dependent anion channel and inhibits apoptotic mitochondrial changes and cell death.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97，3100-3105．