白血病K562/A02细胞MDR1、NF-κB的表达及解毒化瘀中药的调控作用研究

马武开，李玉莹，姚血明，王 莹，黄礼明

(贵阳中医学院第二附属医院血液风湿科，贵州贵阳 550003)

在白血病细胞的耐药机制中，核周因子NF-κB与肿瘤细胞的发生、增殖、分化、凋亡及耐药有密切关系，是多药耐药(multidrug resistance，MDR1)信号转导途径中的主要信号分子，在白血病细胞表达与耐药有关的因素中可能起关键的调控作用。本研究采用血清药理学方法和分子生物学技术研究解毒化瘀药含药血清对人白血病耐药细胞系K562/A02细胞NF-κB信号的影响，探讨解毒化瘀药对K562/A02耐药逆转机制。

1 材料与方法

1.1解毒化瘀方含药血清的制备［1］新西兰大白兔10只灌服解毒化瘀方水煎液(药物由青黛、山慈姑、蚤休、虎杖、莪术、川芎、丹参、补骨脂等组成，按高剂量12 g生药·kg－1灌服，即正常成人用量的2倍)，每日1次，连续3 d，于末次给药后2 h无菌条件下心脏取血，分离血清，组内血清混合，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，置－20℃保存备用。正常兔血清制备:灌药前1 d取兔血，分离血清，方法同前。

1.2主要试剂和仪器主要试剂:RPMI 1640培养粉(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青)、RT-PCR试剂盒(南京凯基生物科技)。主要仪器:PCR梯度循环仪(美国)、紫外可见分光光度计(日本岛津)、凝胶成像分析系统(GE Healthcare)。

1.3 含药血清的细胞毒作用将K562、K562/A02细胞悬液1 ×109·L－1加入 96 孔板中，每孔 100 μl，适应性的培养12 h，实验组用各浓度含药血清培养(共10个浓度)，以不含药正常培养的K562和K562/AO2细胞为对照组，另外设调零孔，最终每孔为200 μl。37℃，5%CO2孵育 48 h，每孔加入5 g·L－1的MTT磷酸缓冲液20 μl，在同样条件下继续培养 4 h，离心(1 000 r·min－1，5min)，弃上清，每孔加 DMSO 150 μl，振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪检测，计算各组细胞毒性。

1.4含药血清对MDR1的表达影响采用RT-PCR法，按试剂说明书提取 RNA，紫外分光光度计测定 RNA纯度(A260/A280＞1.7)，进行RNA定量。重复3次，取平均值。

1.5含药血清对K562/A02细胞NF-κB信号的影响采用Western blot法检测含药血清处理后K562/A02细胞株NF-κB/p65、NF-κB/p50、IκBα 的表达，并设 K562 细胞作对照。

1.6统计学处理实验数据以±s表示，采用SPSS15.0统计软件进行分析，方差齐采用SNK法检验，如方差不齐则用Dunnett’s检验。药物浓度与细胞生长抑制率采用一元线性回归相关分析。

2 结果

2.1含药血清浓度的选择将解毒化瘀药含药血清调为10个不同浓度剂量，分别加入K562/A02细胞，根据含药血清对K562/A02细胞生长抑制作用的一元线性回归分析求得到IC50为＞3 g生药·kg－1体质量。本试验低剂量组采用0.5g生药·kg－1体质量含药血清，中剂量组采用1.5 g生药·kg－1体质量含药血清，高剂量组采用3 g生药·kg－1体质量含药血清(Fig 1);干扰素参照文献［3］采用500 U·L－1。

2.2含药血清对MDR1 mRNA的表达水平的影响K562细胞未见阳性条带，K562/A02细胞牛血清组、兔血清组可见阳性条带，经中药高、中、低剂量含药血清和干扰素处理后MDR1 mRNA条带均变浅。MDR1/β-actin cDNA灰度比值结果示K562/A02细胞MDR1 mRNA水平较K562细胞高(P＜0.01);含药血清和干扰素均能降低K562/A02细胞MDR1 mRNA表达。

2.3含药血清对K562/A02细胞NF-κB信号干预的影响K562未见阳性表达，牛血清组和兔血清组K562/A02细胞p65、p50和IκBα均呈阳性表达，加含药血清处理后p65、p50和IκBα表达呈现不同程度下降，其比值见Tab 1。

Tab 1 Influence of jieduhuayu Chinese herbal serum on NF-κB signal expression in K562/A02 cell(±s，n=3)

Tab 1 Influence of jieduhuayu Chinese herbal serum on NF-κB signal expression in K562/A02 cell(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs calf serum control;★P＜0.05 vs Alpha Interferon control.

K562 cell 0.435 ±0.375 0.313±0.187 0.087 ±0.032 calf serum 1.140 ±0.170 1.013±0.038 0.847 ±0.150 rabbit serum 1.085 ±0.021 0.995±0.025 0.857 ±0.488 Alpha Interferon 0.575 ±0.134＊＊ 0.823±0.061 0.447 ±0.220＊＊A low-dose herbal serum 0.875 ±0.078* 1.170±0.274 0.520 ±0.165*A middle-dose herbal serum 0.705 ±0.106＊＊ 0.663±0.123＊＊ 0.410 ±0.026＊＊A high-dose herbal serum 0.410 ±0.127＊＊★0.468±0.239＊＊★0.317 ±0.038＊＊★

3 讨论

NF-κB参与白血病细胞耐药的途径是由于化疗药物激活NF-κB的转录，导致MDR1及其产物P-gp表达增加，使细胞对化疗药物产生耐药性，抑制其转录活性则可以增加白血病细胞的凋亡从而逆转耐药。在长期的临床实践中，本研究组认识到白血病多药耐药的中医发病原因是由于毒邪留恋，扰乱血络，导致毒瘀互结，病情顽缠，反复发作［2］。在此理论指导下组成解毒化瘀方，经临床和实验证明解毒化瘀药具有逆转K562/A02细胞耐药和提高难治复发白血病化疗缓解率的作用［3－4］。本研究显示解毒化瘀药含药血清能够降低K562/A02 耐药细胞 NF-κB/p65、NF-κB/p50、IκBα 表达，降低MDR1耐药基因的表达，进一步逆转耐药。

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