蓝萼甲素对人宫颈鳞癌SiHa细胞株生长抑制作用

夏 维，王修珍，蒋小岗，顾振纶，郭次仪

(1.苏州中药研究所，2.苏州大学医学部病理学与病理生理学系，江苏苏州 215123)

蓝萼甲素(Glaucocalyxin A)是由唇形科香茶菜属植物香茶菜Rabdosia amethystoieds(Benth)Ham中分离提取出的二萜化合物［1］。研究证明不同浓度的蓝萼甲素可抑制某些肿瘤细胞的增殖，如肝癌 BEL-7402细胞株［2］、卵巢癌HO8910细胞株［3］，然而，蓝萼甲素抑制肿瘤细胞增殖的机制尚未阐明。本文研究了蓝萼甲素对人宫颈鳞癌SiHa细胞凋亡及其生长抑制作用，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1材料蓝萼甲素，上海艾汇生物科技有限公司(纯度≥99.7%，批号:20100513)，溶于 DMSO 中配成50 mmol·L－1的母液;人宫颈鳞癌SiHa细胞株，中国科学院上海细胞生物学研究所。MEM培养基、胎牛血清(Hyclone)，MTT(噻唑蓝)、DMSO(二甲基亚砜)、PI(碘化丙啶)、RNA 酶(Sigma公司)，Hoechst 33258染色试剂盒(上海碧云天生物公司)。

1.2方法

1.2.1细胞增殖抑制测定采用 MTT法检测不同浓度的蓝萼甲素(1.25、2.5、5、10、20 μmol·L－1)对 SiHa 细胞的毒性作用，570 nm处测吸光度值，实验重复3次。

1.2.2Hoechst 33258染色法取对数生长期细胞，接种于24孔板中，次日待细胞贴壁后给予蓝萼甲素浓度分别为2.5、5、10 μmol·L－1，对照组加新鲜培养基，培养 24 h 后按试剂盒操作步骤进行，荧光显微镜观察、摄影。

1.2.3流式细胞仪检测细胞周期改变及凋亡率蓝萼甲素处理细胞24 h后收集细胞，体积分数为70%的乙醇固定过夜，加入PI染色和RNA酶，37℃水浴30 min，用流式细胞仪检测。

1.2.4RT-PCR检测bax、bcl-2、caspase-3、caspase-9 mRNA表达应用Biozol体系，根据说明书步骤进行RNA提取。按TaKaRa试剂盒逆转录mRNA为cDNA。以GAPDH作为内参，以PCR仪进行扩增。引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5统计学处理实验数据采用SPSS12.0统计软件处理，多组比较采用方差分析法，实验结果用±s表示。

2 结果

2.1蓝萼甲素对SiHa细胞的生长抑制作用分析蓝萼甲素对 SiHa细胞具有抑制增殖的作用，12、24、36、48、72 h 的IC50值分别为(17.33±1.90)、(6.84±0.41)、(4.27±0.55)、(2.96 ±0.62)、(1.98 ±0.91)μmol·L－1。随着给药浓度的增加，抑制率增加。给药24 h后细胞抑制率分别为(10.89±2.08)%、(23.05±5.04)%、(42.77±2.14)%、(54.71±2.05)%、(81.96±0.46)%。表明蓝萼甲素对Si-Ha细胞的增殖抑制作用呈明显的时间－剂量依赖性。

2.2Hoechst 33258染色法观察细胞的形态学变化分析荧光显微镜下观察，对照组细胞核大，呈圆形或椭圆形，核内荧光弱，且亮度均一，呈淡蓝色。给药24 h后可见细胞核体积减小，细胞核由于浓集而着色深，呈亮蓝色，部分细胞核呈分叶、碎片状或边集，并随着给药浓度的增加，趋势更加的明显。

2.3流式细胞仪分析不同浓度(2.5、5、10 μmol·L－1)的蓝萼甲素作用SiHa细胞24 h后，流式分析结果显示G1峰前出现亚G1峰，并呈现明显的S期周期阻滞(Tab 1)。

Tab 1 Effect of Glaucocalyxin A on SiHa cells by flow cytometric analysis

2.4RT-PCR检测分析不同浓度(2.5、5、10 μmol·L－1)的蓝萼甲素作用SiHa细胞24 h后，与对照组相比，随着给药浓度的增加 bcl-2 mRNA的表达下降(P＜0.01)，而 bax、caspase-3、caspase-9 mRNA的表达增加(P＜0.01)。

3 讨论

本文研究发现蓝萼甲素能明显抑制人宫颈癌SiHa细胞增殖，且呈时间和剂量依赖性趋势，流式细胞分析结果呈现明显的sub-G1峰和S期周期阻滞，提示这种抑制与其诱导SiHa细胞凋亡和细胞阻滞于S期有关。

细胞凋亡的线粒体损伤的内源性途径通过活化caspase-9来激活凋亡的关键执行者caspase-3［4］。激活的caspase-3裂解相应的胞质胞核底物，导致细胞凋亡［5］。有文献报道［6］bcl-2通过和caspase家族蛋白的作用来抑制凋亡的发生。bcl-2抗凋亡的机制主要有拮抗促凋亡基因bax，抑制促凋亡的蛋白质细胞色素C的释放，从而阻止细胞色素C激活caspase-3［7］。bax基因编码的bax蛋白可以与bcl-2蛋白形成异二聚体，对bcl-2产生阻抑作用［8］。本实验证明蓝萼甲素能降低 SiHa细胞中 bcl-2 mRNA的表达，解除其对caspase-3的抑制，促进细胞的凋亡。本文RT-PCR分析结果显示经蓝萼甲素处理后细胞的bcl-2 mRNA表达下降，而bax、caspase-3、caspase-9 mRNA表达增加，这说明蓝萼甲素能通过下调 bcl-2基因的表达，同时上调 bax、caspase-3、caspase-9基因的表达，从而诱导细胞凋亡和S期阻滞来抑制SiHa细胞的生长。

综上所述，蓝萼甲素在体外明显抑制人宫颈鳞癌SiHa细胞株的增殖，并通过下调bcl-2的表达和上调bax、caspase-3、caspase-9的表达来诱导细胞发生凋亡和周期阻滞。但其体内作用机制与体外实验是否一致以及临床疗效还有待进一步研究。

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