牛磺酸对肾NRK-52E细胞缺氧/复氧损伤的保护及初步机制

龚 慧，万慧芳，王美凤，涂 硕，余乐涵，杨晓红，万福生

(1.南昌大学医学院生物化学与分子生物学教研室，江西南昌 330006;2.南昌市第一医院护理部，江西南昌 330008)

牛磺酸(taurine，Tau)在生物体内参与一系列的生理学过程，如与胆汁酸结合、调节渗透压、细胞钙流动调节、抗氧化和抗心律失常等［1－3］。研究表明［2－3］，Tau 可下调缺血/再灌注(I/R)心肌和肝细胞内质网GRP78、减少细胞凋亡。研究也表明［4］，Tau对大鼠急性肾小管坏死、膜性肾病、糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化等多种肾脏病具有防治作用，其确切机制尚未完全阐明。本实验拟在建立肾小管上皮细胞株NRK-52E细胞缺氧/复氧 (H/R)模型上，观察Tau对NRK-52E细胞H/R损伤的保护作用及其初步机制。

1 材料与方法

1.1材料与分组大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E细胞购自美国ATCC公司。取对数增长期的NRK-52E细胞，随机分为正常对照组、H/R组和H/R+Tau组，具体操作如下:① 正常对照组:正常培养的肾小管上皮细胞。②H/R组:取缺氧8 h/复氧12 h(以Caspase-12活性最强而定)。③ H/R+Tau组:于培养基中加入牛磺酸液(终浓度为10、20、40、80 mmol·L－1)，余操作同 H/R 组。

1.2NRK-52E细胞缺氧/复氧模型的建立从液氮罐中取出冻存的NRK-52E细胞投入37℃的水浴箱中，充分摇动使其尽快解冻，复苏。吸出细胞悬液并滴加10倍体积的含10%(V/V)新生牛血清的高糖 DMEM 培养基，混匀，1 000 r·min－1离心 5 min，弃上清液后再重复洗涤1次。用含10%牛血清的高糖DMEM培养基将细胞悬液稀释混匀，接种于50 ml培养瓶中，37℃下置入体积分数为5%的CO2细胞培养箱中静置12 h，换液除去未贴壁细胞。待细胞汇合80%后换成无血清的高糖DMEM进行同步化培养24 h，而后将培养瓶置于含95%N2-5%CO2(V/V)混合气体的密闭容器中(37℃)进行缺氧孵育8 h，再进行复氧孵育12 h。

1.3台盼蓝排斥试验进行细胞计数及检测细胞存活率制备单个细胞悬液，并作适当稀释(109·L－1)。染色:取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液，混匀。计数:在3 min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。根据下式求细胞存活率/%。

1.4分析GRP78、Caspase-12和Caspase-3的mRNA表达采用TRIzol法提取总RNA，经逆转录后得cDNA，进行PCR。各取 cDNA产物2 μl，待测GAPDH 和 GRP78、Caspase-12、Caspase-3 的正、反义引物(见 Tab 1)各 1 μl(10 μmol·L－1)，2 × Taq PCR Master Mix 8.5 μl，ddH2O 12.5 μl，总反应体积25 μl。反应条件:94℃ 3 min;94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环;结束前72℃延伸10 min。分别取PCR产物6 μl，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察结果，计算并比较各组目的基因的相对表达量。

Tab 1 RT-PCR primer sequences and fragment

1.5检测NRK-52E细胞GRP78、Caspase-12、Caspase-3蛋白的表达经离心收集培养细胞，用预冷PBS漂洗2次，加入含PMSF裂解液400 μl，冰上裂解30 min;然后将细胞转移至 EP管中，离心(12 000×g，4℃)5 min，上清转移至另一 EP管中。取上清50 μl加入2×蛋白提取Loading buffer 40 μl和 10 μl DTT，煮沸 10 min，取 8 μl上样，进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(12%分离胶和5%积层胶)电泳。电泳结束后，将蛋白转移到PVDF膜上;在含5%脱脂奶粉的TBST中缓慢振荡过夜，分别加入抗β-actin兔抗大鼠多克隆抗体(1∶5 000)、抗GRP78兔抗大鼠多克隆抗体(1∶500)、Caspase-12兔抗大鼠多克隆抗体(1∶1 000)和Caspase-3兔抗大鼠多克隆抗体(1∶500)等一抗，室温缓慢振荡2 h后，加入结合缓冲液稀释的二抗，曝光、显影并定影，半定量分析。

1.6流式细胞仪检测肾小管上皮细胞凋亡率采用Annexin V-FITC和PI联合染色的流式细胞仪检测细胞凋亡率。0.25%胰蛋白酶消化收集肾小管上皮细胞。用500 μl Binding Buffer重悬细胞后，加入FITC 标记的Annexin-V(40 mg·L－1)和PI(50 mg·L－1)各5 μl，避光反应 5 min。用 FACScan 检测各组心肌细胞凋亡水平。设正常细胞且不加Annexin V-FITC及PI的一管作为阴性对照组。

1.7流式细胞仪检测肾小管上皮细胞内游离钙离子浓度用0.25%的胰酶消化并收集细胞。钙敏感荧光探针采用Fluo-3/AM，向收集的细胞中加入终浓度为 1 μmol·L－1的 Fluo-3/AM。振荡混匀，37℃避光孵育45 min，再用PBS洗涤2遍，去除未结合的染料。再孵育15 min后送流式细胞仪检测，Fluo-3/AM的激发光488 nm，吸收光526 nm，共计数10 000个细胞，使用荧光强度来反映细胞内钙离子浓度的变化。

1.8统计学处理结果用±s表示，统计方法采用SPSS 13.0统计软件行方差齐性检验、单因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 结果

2.1各组NRK-52E细胞存活率情况对各组细胞进行活细胞计数及细胞存活率的比较(见Tab 2)。细胞给予缺氧/复氧刺激后其生长增值较正常对照组减慢，牛磺酸处理组除10 mmol·L－1浓度组差异无统计学意义外(P＞0.05)，其余浓度组情况均优于H/R组(均P＜0.01)。

Tab 2 Cell count and survival rate in each group(±s，n=6)

Tab 2 Cell count and survival rate in each group(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H/R

Group Cell count/106·L－1Cell survival rate/%Control 6.36 ±0.91 96.79 ±2.31 H/R 3.40 ±0.50＊＊ 52.21 ±6.84＊＊Tau 10 mmol·L－1 3.68 ±0.43＊＊ 56.42 ±6.37＊＊Tau 20 mmol·L－1 4.12 ±0.49＊＊# 63.40 ±8.94＊＊##Tau 40 mmol·L－1 4.89 ±0.78＊＊## 74.49 ±6.76＊＊##Tau 80 mmol·L－1 5.20 ±0.81＊＊## 79.36 ±7.03＊＊##

2.2NRK-52E细胞GRP78、Caspase-12和Caspase-3 mRNA表达变化RT-PCR电泳结果显示，除80 mmol·L－1牛磺酸组外，各浓度牛磺酸处理组GRP78/GAPDH、Caspase-12/GAPDH和Caspase-3/GAPDH光密度值之比与正常对照组相比亦有增高(P＜0.01)，且随着牛磺酸终浓度的增加而呈逐渐降低的趋势(Fig 1)，但均明显低于H/R组(P＜0.05)。

Fig 1 mRNA expression of GRP78，Caspase-12 and Caspase-3 in NRK-52E cells

2.3NRK-52E细胞GRP78、Caspase-12及Caspase-3蛋白表达变化Western blot方法检测各组NRK-52E细胞 GRP78、Caspase-12及 Caspase-3蛋白表达。结果显示(Fig 2)，与正常对照组相比，H/R组和各浓度牛磺酸处理组的 GRP78、Caspase-12及Caspase-3蛋白表达均明显增高(P＜0.01);但牛磺酸处理组GRP78、Caspase-12及Caspase-3蛋白表达量均低于H/R组，差异具有显著性(P＜0.01)。

Fig 2 Protein expression of GRP78，Caspase-12 and Caspase-3 in NRK-52E cells

2.4各组NRK-52E细胞Caspase-3活性和凋亡率经荧光分析测得H/R组(2.88±0.19)NRK-52E细胞Caspase-3活性是对照组(0.31±0.06)的9.3倍(P＜0.01);各浓度牛磺酸处理组的Caspase-3活性为(1.23±0.16)、(0.95±0.09)、(0.75±0.08)和(0.48±0.06)，与 H/R组比较均降低(P＜0.01)，且有剂量依赖性。表明牛磺酸对H/R损伤NRK-52E细胞的Caspase-3活化升高有较好的抑制作用。

Annexin-V/PI双染法流式细胞仪检测结果显示，与正常对照组相比，H/R组凋亡程度明显增加(P＜0.01);与H/R组比较，牛磺酸处理组细胞凋亡率明显降低，除10 mmol·L－1浓度组外，凋亡率与H/R组相比差异有显著性(P＜0.01)。表明牛磺酸可减少由缺氧/复氧引起的NRK-52E细胞凋亡并且呈现一定的剂量依赖性(Fig 3)。

2.5NRK-52E细胞胞内Ca2+荧光强度的变化流式细胞仪检测显示NRK-52E细胞H/R后平均胞内钙荧光强度值明显升高(P＜0.01)，与H/R组相比，牛磺酸处理后平均胞内钙荧光强度值下降(P＜0.05)，且随牛磺酸终浓度的增加，平均胞内钙荧光强度值有逐渐降低的趋势，并呈现一定的剂量依赖性(Fig 4)。

Fig 3 The change of apoptotic rate in NRK-52E cells by flow cytometry

Fig 4 The fluorescence intensity of intracellular Ca2+in NRK-52E cells

3 讨论

大量研究表明［5－7］，肾缺血/再灌注诱导了内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反应。ERS是诱导心肌和肾脏等重要脏器细胞损伤的重要因素［8－9］，Bando 等［10］发现急性肾衰患者的肾组织出现ERS，在低氧状态下培养的肾小管细胞也出现ERS。Hao等［11］和 Montie 等［12］发现肾小管上皮细胞缺氧/复氧可触发 ERS，包括诱导 GRP94、CHOP表达，激活Caspase-12，诱导细胞凋亡。本实验结果显示，NRK-52E细胞缺氧/复氧刺激后，ERS蛋白GRP78表达明显上调，细胞凋亡率增加。说明ERS参与了大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤。近年来研究证实，肾小管上皮细胞凋亡在肾缺血/再灌注损伤过程中起关键作用［13］，激活肾小球和肾小管上皮细胞凋亡的途径包括存活因子的缺失、死亡受体激活、线粒体损伤、溶酶体失稳态和ERS等［14］。本实验结果显示:NRK-52E细胞缺氧/复氧刺激后，ERS标志性蛋白GRP78和内质网特异性凋亡诱导蛋白Caspase-12升高，表明肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤可通过内质网应激并活化Caspase-12来触发凋亡。牛磺酸处理组 NRK-52E细胞 GRP78、Caspase-12和Caspase-3表达及细胞凋亡率均下降。提示牛磺酸能抑制缺氧/复氧刺激引起NRK-52E细胞凋亡，其部分机制是通过抑制内质网Caspase-12凋亡信号通路而实现的。

有研究认为内质网在维持胞内游离Ca2+稳态方面发挥了关键性作用。静息状态下，内质网中Ca2+浓度比胞质高得多，维持这一外低内高的Ca2+梯度和Ca2+稳态是内质网上3种与Ca2+的摄入和释放相关的通道［15］，分别是将Ca2+从胞质中转运至内质网的Ca2+泵(Ca2+ATPase)或肌质网Ca2+泵(SERCA)以及向胞质内释放 Ca2+的 1，4，5-三磷酸肌醇受体(IP3R)和蓝尼叮受体(ryanodine receptor，RyR)。为进一步深入研究Tau在调节缺氧/复氧刺激后NRK-52E细胞内Ca2+稳态的作用，用流式细胞仪检测了NRK-52E细胞内钙荧光强度。结果发现，H/R组平均胞内钙荧光强度值较对照组有明显升高(P＜0.01);与H/R组相比，牛磺酸处理组平均胞内钙荧光强度下降(P＜0.05)，且呈一定的剂量依赖性，说明牛磺酸具有减少细胞内游离钙离子浓度，抑制钙超载的作用。总之，本文结果表明，牛磺酸对肾小管上皮NRK-52E细胞缺氧/复氧损伤具有较好的抑制作用，且呈一定剂量依赖性，其机制主要是降低内质网应激蛋白GRP78和 Caspase-12、Caspase-3的表达，调节胞内钙稳态，减少细胞凋亡，详细机制有待进一步深入研究。

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