全反式维A酸对子宫肌瘤发生及iNOS表达的意义

祁 欢，薛永志，洪高明

(1.包头医学院药理学教研室，内蒙古包头 014060;2.包头医学院第一附属医院妇产科，内蒙古包头 014010)

子宫肌瘤是子宫平滑肌细胞过度增殖的性激素依赖性疾病，其生长和退化在细胞以及分子水平上的机制仍未阐明［1］。血管新生参与肿瘤及多种疾病的病理过程，而子宫肌瘤的发生发展也极大地依赖血管新生的作用。全反式维A酸(ATRA)作为经典的细胞诱导分化剂，促进细胞分化，抑制肿瘤细胞诱导的血管新生［2］，可对子宫肌瘤的发病过程有影响。一氧化氮(NO)参与血管扩张、血管通透性、血小板黏附和聚集等，也参与子宫肌瘤的病理过程［4］。探讨活性氧自由基NO与肿瘤的关系是近年来肿瘤病因学研究的一个热点，而国内外有关RA对雌、孕激素负荷法建立的大鼠子宫肌瘤中NOS的影响的报道尚不多见。本研究以雌、孕激素负荷法建立大鼠子宫肌瘤模型［5］，观察应用ATRA前后子宫外观及镜下改变，以及RARα、iNOS的表达情况，深入探讨ATRA在子宫肌瘤过程中的作用及其作用环节，为子宫肌瘤的药物治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1实验动物和主要试剂清洁级♀Wistar大鼠60只，体质量(170±10)g，动物许可证号:SCXK(蒙)2002-0001，购自内蒙古大学实验动物中心。苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate，E2)注射液，天津金耀氨基酸有限公司，1 g·L－1，批号:H12020529;黄体酮(progesterone，P)注射液，20 g·L－1，上海通用药业股份有限公司，批号:H33020828;ATRA标准品，购自郑州荔诺生物科技有限公司;兔抗大鼠RARα多克隆抗体、兔抗大鼠iNOS多克隆抗体，即用型SABC免疫组化试剂盒，DAB显色剂均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2主要仪器Sartorius BS210S电子天平，德国Sartorius公司;CX41RF奥林帕斯显微镜;形态分析系统，江苏省捷达科技发展有限公司。

1.3动物分组及建模方法Wistar大鼠60只，经1周的喂养适应后，随机分为5组，每组12只，A组(对照组)，给予NS，剂量、时间等均与雌孕激素给药情况相同;B组(模型组)，给予苯甲酸雌二醇注射液(0.59 mg·kg－1·d－1，wk1 ～ 12，im)、黄体酮注射液(5.9 mg·kg－1·wk－1，wk1 ～ 12，im);C 组(ATRA低剂量组)，给予雌孕激素给药情况同B组，于第 10周起给予 ATRA(0.25 mg·d－1，d1～14，ip);D组(ATRA中剂量组)雌孕激素给药情况同B组，于第10周起给予 ATRA(0.5 mg·d－1，d1～14，ip);E组(ATRA高剂量组)雌孕激素给药情况同 B 组，于第10 周起 ATRA(1 mg·d－1，d1 ～14，ip)。第12周末处死所有大鼠，剪取子宫使之离体、拍照，电子分析天平称取子宫湿重(g)，计算子宫系数(子宫重量:大鼠体质量mg·g－1)，游标卡尺测量左、右宫角长度(mm)、宫角最大直径(mm)、宫颈长度(mm)、宫颈宽度(mm)。4%多聚甲醛溶液固定子宫标本，取子宫分角以上0.5 cm相同部位一段子宫，石蜡包埋、切片、HE染色，光学生物显微镜观察平滑肌细胞的病理改变。

Tab 1 Rat uterus wet weight，uterus weight/body weight，various uterus radial line in all groups(±s，n=12)

Tab 1 Rat uterus wet weight，uterus weight/body weight，various uterus radial line in all groups(±s，n=12)

A:Control;B:Model;C:ATRA low-dose;D:ATRA mid-dose;E:ATRA high-dose.＊＊P＜0.01 vs A group;#P＜0.05 vs B group

Group Uterus wetwt/g Uterus/%of body weight Left uterus horn/mm Right uterus horn/mm Uteru s horn max dia/mm Cervix length/mm A 0.36 ±0.06 1.41 ±0.09 21.94 ±2.57 17.77 ±2.353.39 ±0.47 3.16 ±0.55 B 4.11 ±0.48＊＊ 15.39 ±0.96＊＊ 46.34 ±9.57＊＊ 39.86 ±9.21＊＊ 8.14 ±1.08＊＊ 6.24 ±0.82＊＊C 2.51 ±0.15# 8.33 ±0.85# 31.24 ±5.76# 27.43 ±5.01# 5.60 ±0.65# 3.61 ±0.72#D 3.07 ±0.65# 7.89 ±0.95# 26.55 ±4.02# 22.77 ±3.17# 5.33 ±0.58# 2.95 ±0.46#E 3.45 ±0.61# 6.12 ±0.69# 24.35 ±3.78# 21.55 ±3.52# 5.34 ±0.76# 2.94 ±0.58#

1.4免疫组化法测定RARα、iNOS的表达采用免疫组化ABC法分别测定RARα、iNOS在各组大鼠子宫肌层中的表达情况，具体步骤按试剂盒说明书方法操作，一抗稀释倍数为1∶100。每张切片选择染色良好区域，随机观察10个高倍视野。RARα、iNOS均以细胞染成棕黄色为阳性，采用形态分析系统统计每个视野中阳性细胞率，细胞阳性率以高倍镜下每视野光密度值(OD)来表示。

1.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行分析，单因素方差分析进行组间比较，实验结果用±s表示。

2 结果

2.1ATRA对各组大鼠子宫湿重、子宫系数、子宫各径线的影响经过12周雌孕激素负荷刺激，B组大鼠子宫湿重，子宫系数及各径线值明显增加(P＜0.01);而C、D、E三组大鼠子宫湿重，子宫系数及各径线值均小于B组(P＜0.05)，而这种作用在给药组间差异并未呈显著性(P＞0.05)，见Tab 1。

2.2造模、给药后各组大鼠子宫大体外观改变，及镜下病理组织学特征正常对照组大鼠子宫质地均匀，色泽鲜亮粉红，未见结节、囊肿及肿胀。雌、孕激素负荷造模后，子宫色泽晦暗，明显肿胀，甚至可见宫角局部肿块;而ATRA给药3组中大鼠子宫外观都有所改变，尤其在中、高剂量组中子宫色泽明显鲜亮，表面光滑，宫体明显缩小(Fig 1)。

HE染色显示，正常对照组大鼠子宫平滑肌层较薄，平滑肌细胞细长，排列整齐，呈梭形，细胞核杆状，核仁不清，有少许嗜酸性细胞，偶见淋巴细胞。模型组大鼠子宫平滑肌出现多发性、局灶性增生，局部平滑肌增厚，细胞明显粗大、增粗，肌纤维增粗，排列紊乱，有的肌层细胞纵横交错，呈栅栏状改变;细胞核增大，呈短梭形或椭圆形，核仁清晰，结缔组织增生明显。ATRA治疗组大鼠子宫平滑肌局灶性增生区域明显减少，核以梭形、杆状居多，少数呈椭圆形，核仁不清，大部分平滑肌层略厚，肌细胞排列较整齐(Fig 2)。

2.3RARα的表达情况与ATRA治疗之间的关系光镜下，大鼠子宫组织RARα的阳性细胞呈明显的棕黄色，分布于细胞核中，表达强度不一。A组几乎看不到表达阳性的细胞，而在其它4组中表达RARα阳性的细胞满视野清晰可见(如Fig 3)。与A组相比，B组的RARα细胞阳性率明显增高(P＜0.05)，与B组相比，C、D、E 3组的 RARα细胞阳性率差异则无统计学意义(P＞0.05)，见Tab 2。

2.4ATRA对大鼠子宫组织内iNOS表达的影响光镜下，大鼠子宫组织iNOS的阳性细胞呈棕黄色，弱表达于细胞质中，各组的表达强度不一，A组中几乎看不到棕黄色染色细胞，而B组却清晰可见，而D、E组的细胞染色状况与对照组几乎完全相同(如Fig 4)。形态分析系统统计每个视野中阳性细胞数的比率，与A相比，B组iNOS的阳性表达率明显增加(P＜0.05)，与B组相比，C组阳性表达率无统计学意义(P＞0.05)，而D、E组的阳性表达率则明显降低(P＜0.05)，但二者之间的差异无统计学意义(P＞0.05)，见Tab 2。

Tab 2 Number of RARα and iNOS positive cells/high-power field in all groups(±s，n=12)

Tab 2 Number of RARα and iNOS positive cells/high-power field in all groups(±s，n=12)

*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group

Group RARα/S × OD μm2/view iNOS/S × OD μm2/view A 56.2 ±5.0 104.5 ±14.8 B 68 554.6 ±5 232.7* 4 421.8 ±466.5*C 75 545.2 ±8 227.5* 5 858.4 ±627.5 D 63 690.4 ±6 858.2* 232.6 ±36.2#E 71 564.3 ±6 352.3* 133.1 ±15.4#

Fig 1 Alteration of uterine appearance in each group Fig 2 Pathological features in uterus by HE in each group(HE strains，×200)Fig 3 Immunohistochemistry of RARα expression in rat uterus(immunohistochemistry strains，×400)Fig 4 Immunohistochemistry of iNOS expression in rat uterus(immunohistochemistry strains，×400)

3 讨论

在以往的大鼠子宫肌瘤造模试验中激素的给药时间均大于20周，雌、孕激素的给药量也均小于本试验的给药量，所以在缩小给药时间加大给药剂量的新情况下同样可以成功建立子宫肌瘤模型，这一结果与Minnie Malik等的研究结果相吻合［6］。Wil Catherino等［3］通过高效液相色谱证实在与正常子宫肌层相比较时，肌瘤组织中ATRA及9-cisRA的表达下降，这一结论也更加支持我们应用ATRA来治疗子宫肌瘤的设想。本次研究中发现雌孕激素刺激后子宫肌瘤组织中RARα和iNOS的表达明显增加，RARα的高表达也正是应用ATRA治疗的动机所在。平滑肌瘤表型的特性体现在胞外基质的过度分裂，有研究表明分化模式的改变在各种正常组织中，以及肿瘤组织中均被发现是受RA所影响［6］。试验中发现平滑肌细胞的增殖被ATRA所抑制，这种抑制也呈剂量依赖性，并且肌瘤细胞对ATRA的敏感性要比肌层细胞更高［7］，表明RARα在大鼠子宫肌瘤模型中高表达，这说明这些肿瘤也都有潜在的RA治疗的有效性，而我们所得出的结果也正是证实了这一推断。

近年大量研究资料显示多种妇科肿瘤组织中同样存在iNOS高表达，表明NOS在许多肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的作用。本研究运用免疫组化技术显示iNOS在子宫肌瘤组织中的表达高于正常子宫平滑肌组织，我们得到的结果表明iNOS的过表达与子宫肌瘤的发生、发展过程有关，它们可能在子宫肌瘤的发病机制中起一定作用，如参与肌瘤细胞的增殖与分化，但NO和NOS究竟是通过哪条途径促进子宫肌瘤的发生、发展，还有待于进一步探讨。在ATRA组内，其表达的阳性率比模型组明显降低，说明ATRA有抑制iNOS产生的作用，进而发挥其抗肿瘤保护子宫平滑肌的作用。而ATRA发挥作用是需要通过其受体RARα。iNOS是通过诱生催化左旋精氨酸上的胍基氮，来诱生产生大量NO，强烈舒张血管，增加血流量，也是维持肿瘤生长的必须条件。多项研究证实，维A酸能抑制血管生成因子活性，抑制内皮细胞的增殖及迁移，诱导血管生成因素如内皮抑素、血管抑素的产生［8］。NO又可产生氮氧自由基和大量亚硝酸盐引发组织产生氧化/硝化应激，激活核转录，引发大量细胞因子产生［9］，这极有可能参与肌瘤的发生发展。关于ATRA如何降低iNOS阳性表达率的机制尚不清楚，有待进一步深入研究。

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