凝血栓蛋白-1基因N700S多态性与冠心病的关联研究

施育平，龚化兰，刘海波，单 江，徐 耕，王建安

(浙江大学医学院附属第二医院心内科，浙江 杭州 310009)

凝血栓蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)又称血小板反应素-1，为一种细胞外基质蛋白，大量存在于血小板颗粒和细胞外基质中。现已发现，多种细胞包括激活的血小板、成纤维细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞等都可以合成并分泌TSP-1，其与一系列因子相互作用，调控血小板粘附和聚集、血管平滑肌细胞增殖等细胞功能［1］。TSP-1基因第l3外显子编码钙结合域存在N700S单核苷酸多态性(Single Ncleotide Polymorphisms，SNP)A8831G，即其编码的第 700位氨基酸-丝氨酸被天冬氨酸替代，可以形成AA、AG及GG三种不同的基因表型。Topol等［2］对 352 例冠心病(coronary artery disease，CAD)患者，其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)190例和 418例对照者的GeneQuest研究发现，携带700S等位基因早发AMI的危险性是正常人的9倍，可以用来预测AMI发生。随后意大利学者［3］的研究重复了以上研究结果，但荷兰［4］、日本［5］等相关研究均未证实以上结果。这提示该基因多态性与冠心病相关可能与种族和地区有关。因此，我们以2005年3月至2007年3月我院住院行冠状动脉造影患者为研究对象，采用聚合酶链反应(PCR)行TSP-1单核苷酸多态性研究，探讨其与中国浙江地区汉族人群冠心病的相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象 ①CAD组:为178例冠心病患者，其中男110例，女68例，平均年龄(61.8±10.3)岁，均选自2005年3月至2007年3月因胸痛入住浙江大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，经冠状动脉造影检查，以冠状动脉主要分支左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)、右冠状动脉(RCA)中任何一支血管内径狭窄≥50%为阳性;其中急性心肌梗死者55例，病例均符合2002年AHA/ACC关于AMI诊断指南的诊断标准［6］。②Control组:正常对照组，158例，其中男85例，女73例，平均年龄(59.8±10.8)岁，选自同期因疑似冠心病入住浙江大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，经心电图、运动平板、心肌酶谱等排除冠心病诊断，所有入选者经冠脉造影证实其主要血管完全正常。

本研究所有受试者均为中国浙江地区汉族人，个体之间无血缘关系。对照组与冠心病组相比，年龄及性别构成差异均无显著性(P均＞0.05)，排除合并有先天性心脏病、心肌病、心脏瓣膜病;肾脏和肝脏疾病患者;数月前有手术和外伤者;恶性肿瘤及发热性疾病等;详细调查吸烟史，同时检测血压、血脂和空腹血糖等指标。

1.2 DNA提取 所有研究对象均于手术当天采集静脉血2 ml，EDTA抗凝，分离血浆和白细胞，血浆－20℃冻存，白细胞层采用酚/氯仿法提取基因组DNA。

1.3 TSP-1基因扩增、电泳 以提取的基因组DNA为模版，采用聚合酶链反应(PCR)扩增TSP-1基因片段，引物设计参考文献［5］，上游P1为5'-AAG AAC GCC AAG TGC AAC TAC-3';下游P2为5'－AGA GCT AGC CCT GTT CAT GTT-3'，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增参数:94℃预变性5 min→94℃变性60 s→58℃退火60 s→72℃延伸40 s，32个循环，最后72℃延伸8 min。反应结束后，取PCR产物 10 μl经 2%琼脂糖凝胶电泳，90 mV，30 min，凝胶成像分析系统观察扩增结果，结合DNA分子量标准判断是否为目的片断，扩增产物约为360 bp。

1.4 TSP-1基因扩增产物的限制性酶切、电泳酶切反应体系20 L，其中按照设计引物扩增出360 bp 长度的 PCR 产物 10 μl，BseNI内切酶 5 U，Bufer B 2 μl，65℃反应 16 h。反应终止后，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统观察酶切结果。

1.5 统计分析 采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析处理，计量资料以表示，均进行正态性检验后行t检验;用Hardy-Weinberg平衡确认其群体代表性，基因型和等位基因频率等计数资料采用直接计数法，组间比较行χ2检验;以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CAD组和正常对照组一般资料的比较两组年龄、性别、高血压患者比例比较差异无显著性(P＞0.05)。CAD组吸烟发生率明显高于正常对照组，两者比较差异有显著性(P＜0.01)。两组间甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等血脂比较差异无显著性，但CAD组患者的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)明显低于正常对照组(P＜0.01)。两组间空腹血糖值比较差异无显著性，但糖尿病患者比例明显高于正常对照组(P＜0.01)。两组间收缩压比较差异有显著性，但舒张压比较差异无显著性。见表1。

表1 CAD组和正常对照组临床和实验室资料Table 1 The clinical and laboratory date in CAD group and control group

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 CAD组和正常对照组的TSP-1基因型分布χ2值分别为0.013和0.002，P值均 ＞0.05，符合 Hardy-Weinberg平衡(表2)。这说明样本具有群体代表性。

2.3 正常对照组和CAD组TSP-1基因型及等位基因频率分布 AA野生型不被BseNI内切酶酶切，电泳结果为360 bp的单一条带;AG杂合型被酶切成360、250、110 bp三条带，GG突变型酶切后应为250、110 bp两条带(图1、2)。在所有被检测的336例对象中，正常对照组158例，CAD组178例。两组均以AA型为主，仅检测出AG杂合型4例，未检测到一例GG纯合子(表3)。两组中AG杂合型所占比例比较差异无显著性，AG型和CAD发病无相关性(χ2=0.788，P=0.375;AG 对 AA:OR=2.691，95%CI:0.277～26.140)。同时，两组 G 碱基频率比较也无显著性差异(χ2=0.784，P=0.376)。G等位基因在本研究正常对照组及CAD组中的频率分别为0.3%和0.8%。

表2 TSP-1基因型分布频率及遗传平衡吻合度检验Table 2 The distributions of TSP-1 genotypes and Hardy-Weinberg examination

图1 PCR产物的凝胶电泳Fig.1 Agrose gel electrophoresis of PCR products

图2 PCR产物的酶切电泳结果Fig.2 The distributions of TSP-1 polymorphisms

2.4 正常对照组和AMI组TSP-1基因型及等位基因频率分布 在所有被检测的158例正常对照组及55例AMI组中，两组均以AA型为主，仅检测出AG杂合型3例，未检测到一例GG纯合子(表4)。两组中AG杂合型所占比例比较差异无显著性(χ2=2.650，P=0.104)。同时，两组G等位基因频率比较差异无显著性(χ2=0.823，P=0.364)。

表3 CAD组和正常对照组TSP-1的基因型和基因频率比较Table 3 The distributions of TSP-1 polymorphisms in CAD group and control group

表4 AMI组和正常对照组TSP-1的基因型和基因频率比较Table 4 The distributions of TSP-1 polymorphisms in AMI group and control group

3 讨论

TSP-1的编码基因位于15q15上，由186个氨基酸残基组成，分子量为450 kD，为三条相同肽链构成同源三聚体蛋白结构。在透射电镜下，该三聚体的每条单链均由球状氨基末端(NTD)、球状羧基末端构成(CTD)，中间连以细长，易弯曲的杆状臂。TSP-1其分子结构复杂，功能多样。根据TSP-1与与其它分子的相互作用。可将每条单链分成5个功能区:①末端肝素结合区，②与Ⅰ型前胶原区胶原同源的片段，③与备解素同源含三个重复系列的Ⅰ型重复区，④与表皮生长因子(EGF)同源含三个重复系列的Ⅱ型重复区，⑤与钙调素同源含七个结合Ca2+的Ⅲ型重复区。TSP-1其编码区A8831G碱基系列的SNP导致其700位氨基酸由天冬氨酸转化为丝氨酸(700N→S)，该碱基系列位于Ⅱ型与Ⅲ型重复区(Ca2+-binding site)的交界处［7］。研究发现，此点的突变可导致 Ca2+结合率下降［8］。

运用TSP SNP重组片段(Ⅲ型重复区+N700，Ⅲ型重复区+S700，Ⅲ型重复区+Ⅱ型重复区+N700，Ⅲ型重复区+Ⅱ型重复区+S700)，添加Ca2+，分析SNP N700S附近一单色氨酸的内在莹光，研究者发现S700的EC50需要更高的Ca2+浓度。这预示SNP导致了构像改变。进一步研究发现，S700片段的构象对热变性更敏感:S700达到Ca2+完全饱和状态发生在50℃，而N700在65℃。这些研究表明，S700 SNP更易于解离Ca2+和热变性［9］。总之，这两个研究都表明S700 SNP的构象更不稳定。可推断:SNP影响TSP的构象从而影响Ca2+亲和力。TSP-1蛋白N700S置换导致其钙结合域对Ca2+亲和力降低，增加了TSP-1致血小板的聚集和释放功能，并使斑块趋向不稳定为其引起 AMI的可能机制［10］。

Topol等［2］于2001年在英国进行的GeneQuest研究首先发现，携带700S等位基因早发AMI的危险增高9倍，并可以预测AMI的发生。同样，Jeffrey等［11］在意大利的多中心大样本量的研究也表明，TSP-1基因N700S多态性与急性心肌梗死的发生有关，但2008年Koch教授对既往该基因多态性与急性心肌梗死的Meta分析，未提示该基因多态性与心肌梗死有关［12］。目前，国内关于TSP-1基因N700S多态性与冠心病的关系也有相关报道，Lei等［13］的研究表明，TSP-1基因G等位基因的频率在对照组及心肌梗死组分别为0.6%及1.7%，G等位基因在心梗组频率有增加的趋势，但无显著性差异。综上所述，TSP-1基因N700S多态性与冠心病之间的关系还存在争议，因此，需要更多更大量的研究来进一步证实。本研究在中国浙江地区汉族人中探讨TSP-1基因N700S单核苷酸多态性与冠心病的关系，发现在浙江汉族人群中存在TSP-1基因N700S多态性，G等位基因在正常人群、CAD及AMI组中的频率分别为 0.3%、0.8%及1.8% ，相对于西方人群显著偏低(11%)［12］，但与Lei在中国人群研究中的频率相似(对照组与心肌梗死组分别为0.6%及1.7%)。在本研究中G等位基因频率在CAD及AMI中有增加的趋势，但未达到统计学差异，鉴于G等位基因在中国人群中的频率很低，这可能需要更大样本量及更进一步的研究来验证。

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