维生素E琥珀酸酯联合紫杉醇对Her-2过表达乳腺癌细胞的诱导凋亡研究

赵妍 李里 姜秋颖 申维喜 武露艳 阎婷婷

哈尔滨医科大学附属第二医院肿瘤内科，黑龙江 哈尔滨 150086

乳腺癌是危害女性健康的常见恶性肿瘤，其发病率占妇女肿瘤的31%，其中有10%～34%属于Her-2基因过表达［1］。目前，紫杉醇已成为治疗乳腺癌的有效药物之一。研究证明，乳腺癌细胞中Her-2基因的过度表达降低了其对紫杉醇的敏感性［2-4］，Bcl-2蛋白是一种重要的细胞凋亡抑制蛋白，有研究报道，Bcl-2可使肿瘤细胞对紫杉醇产生抗药性，相反降低细胞Bcl-2的水平可使细胞对紫杉醇敏感［5］。维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然维生素E的酯化衍生物，可诱导肿瘤细胞凋亡，却对正常细胞组织没有毒性作用［6］。研究报道VES作用于白血病细胞Raji、前列腺癌细胞后，Bcl-2蛋白表达下降［7-8］，本研究以VES、紫杉醇单独及联合作用于Her-2过表达乳腺癌细胞MDA-MB-453，通过检测其诱导凋亡率，判断VES对紫杉醇诱导Her-2过表达乳腺癌细胞MDA-MB-453的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

VES为Sigma公司产品；紫杉醇为百时美施贵宝公司产品；鼠抗人Her-2单抗、SP检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司；TUNEL凋亡检测试剂盒购自Roche公司(产品规格：20T，产品货号：SK-9000)；流式细胞仪为哈尔滨医科大学公卫学院提供。

1.2 细胞与细胞培养

人乳腺癌MDA-MB-453细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院；优级胎牛血清为杭州四季青公司产品；RPMI 1640培养基为北京赛默飞世尔生化制品有限公司产品。MDAMB-453细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中于37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。

1.3 免疫细胞化学法检测MDA-MB-453细胞株Her-2蛋白的表达

取对数生长期MDA-MB-453乳腺癌细胞株于离心管中离心(1 000 r/min，离心半径为13.5 cm，5 min)，弃上清液，加中性甲醛固定(甲醛与细胞量之比为7∶1)后制备成石蜡切片，共制备5张切片，按照Her-2染色试剂盒操作步骤检测表达率。

1.4 流式细胞仪检测该细胞株的自身凋亡率及VES组和乙醇组MDA-MB-453细胞株的凋亡率

取对数生长期MDA-MB-453细胞，用RPMI 1640和10%FS培养液充分吹打使细胞混匀，细胞计数为71×104/mL，为达到2×106/mL的上机标准，于1 000 r/min离心5 min后去上清液，各加1 mL正常培养液充分吹打使细胞混匀后，吸出移至2个EP管中并分别标记为0和1，再离心弃上清液加PBS冲洗离心3次(1 000 r/min，离心半径13.5 cm，5 min)，加 200 μL Binding Buffer，培养 36 h 后加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI轻混匀，避光反应10 min后追加300 μL Binding Buffer后上机。乙醇组除所用培养液为0.15%的乙醇+RPMI 1640+10%FS，其他操作同上。VES组除培养液为15 mg/L VES+ RPMI 1640+10%FS，其他操作同 上，以上步骤每组均重复3次。

1.5 TUNEL法检测不同浓度的VES及不同浓度的紫杉醇分别单独作用于MDA-MB-453细胞株的凋亡率

VES以0.15%的乙醇溶解，配制成浓度为10、20 mg/L的VES。取对数生长期的MDAMB-453细胞珠接种于96孔板中，细胞计数每孔约1×106个，加培养液至300 μL，分别用10、20 mg/L的 VES，50、100 nmol/L的 紫 杉醇处理MDA-MB-453细胞24、48 h后，参照TUNEL试剂盒染色检测细胞凋亡，计算凋亡指数，凋亡指数(AI)=(凋亡细胞数/计数总细胞数)×100%。

1.6 TUNEL法检测VES联合紫杉醇作用于MDA-MB-453细胞株的凋亡率

VES联合紫杉醇作用于MDA-MB-453细胞， 共8组， 第1组：VES 10 mg/L， 紫 杉醇50 nmol/L，作用时间24 h；第2组VES 10 mg/L，紫杉醇50 nmol/L，作用时间48 h；第3组VES 10 mg/L，紫杉醇100 nmol/L，作用时间24 h；第4组：VES 10 mg/L，紫杉醇100 nmol/L， 作 用 时 间 48 h；第 5组：VES 20 mg/L，紫杉醇50 nmol/L，作用时间24 h；第 6组：VES 20 mg/L， 紫 杉 醇 50 nmol/L，作用时间48 h；第7组：VES 20 mg/L，紫杉醇100 nmol/L，作用时间24 h；第8组：VES 20 mg/L，紫杉醇100 nmol/L，作用时间48 h；各组药物分别作用于MDA-MB-453细胞，参照TUNEL试剂盒染色检测细胞凋亡，计算凋亡指数。

1.7 统计学处理

采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，显著性比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫细胞化学法检测乳腺癌细胞MDAMB-453的Her-2表达水平

5张切片Her-2蛋白表达率分别为65.30%、68.67%、63.64%、65.12% 和69.57%，其95%CI：63.32%～69.60%，进一步验证了MDA-MB-453细胞为Her-2蛋白过表达乳腺癌细胞(图1)。

2.2 MDA-MB-453细胞株的自身凋亡率及VES组和乙醇组作用于该细胞株的凋亡率

MDA-MB-453细胞的自身凋亡率为2.1%。0.15%的乙醇作用于MDA-MB-453细胞株36 h后的凋亡率为2.4%。15 mg/L的 VES作用于MDA-MB-453细胞株36 h后的凋亡率为9%。和空白对照组相比，乙醇组凋亡率改变不明显(P＞0.05)，VES 组凋亡明显 (P＜0.05)。

2.3 VES和紫杉醇单独作用以及联合作用于MDA-MB-453细胞的凋亡率

VES单独作用可诱导Her-2过表达乳腺癌细胞凋亡，并成剂量和时间依赖关系；紫杉醇单独作用诱导Her-2蛋白过表达乳腺癌细胞凋亡呈剂量和时间依赖关系(表1)。

VES和紫杉醇联合作用的TUNL染色结果见图2，根据染色结果计算凋亡指数，可见VES联合紫杉醇作用于Her-2过表达乳腺癌细胞后，对细胞增殖的抑制作用较两药单药作用时明显增强，具有统计学意义(P＜0.05，表1)。但这种诱导凋亡作用不成剂量和时间依赖关系，其中以10 mg/L的 VES联合100 nmol/L的紫杉醇作用时间为48 h对MDA-MB-453细胞的诱导凋亡作用最强。

表 1 两种药物单独及联合对Her-2过表达乳腺癌细胞的诱导凋亡率Tab.1 The induction of apoptosis by the two drugs in breast cancer cells

3 讨 论

乳腺癌是危害女性健康的常见恶性肿瘤，其发病率占妇女肿瘤的31%，目前的治疗手段基本可以使患者获得较高的生存率。紫杉醇是治疗乳腺癌的有效药物之一，其机制主要是促进微管聚合和稳定已聚合微管，将细胞阻滞于G2/M期，抑制肿瘤细胞的迁移，激活免疫细胞等对乳腺癌细胞进行杀伤［9-10］。然而，约有30%的乳腺癌患者为Her-2基因过表达，研究表明其对化疗药物存在明显耐药，常导致化疗失败［11］。Ciardiello等［12］也已证明Her-2基因过表达的乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性下降，为了提高紫杉醇的疗效，可以寻找一些紫杉醇化疗增敏的途径。

VES可使肿瘤细胞阻滞于G1期，对恶性肿瘤细胞有特异性的生长抑制作用，却对正常细胞组织没有毒性作用。研究表明，VES对乳腺癌、前列腺癌、舌癌及肾癌等恶性肿瘤均具有显著的诱导凋亡作用［13-16］。经证实，VES在体外诱导乳腺癌细胞凋亡，在体内对荷乳腺癌小鼠有抑瘤作用［17-18］。

本实验用免疫细胞化学法验证了MDAMB-453乳腺癌细胞为Her-2蛋白过表达乳腺癌细胞，以50、100 nmol/L的紫杉醇作用于MDA-MB-453细胞24、48 h后的诱导凋亡率分别为：15.3%、17.9%、23.5%和29.3%。以10和20 mg/L的VES作用于MDA-MB-453细胞24、48 h后的凋亡率分别为13.6%、16.28%、45.5%和48.84%。说明紫杉醇和VES对Her-2蛋白过表达乳腺癌细胞MDA-MB-453均有诱导凋亡作用，这种作用成浓度和时间依赖关系。本研究再以两药联合作用于MDAMB-453细胞，结果表明两药联合的诱导凋亡率明显高于单药，并证实两药有协同作用(P＜0.05)，随着对VES的深入研究，其有望成为紫杉醇化疗药物发挥疗效的增敏剂。

已证实 Bcl-2蛋白是一种重要的细胞凋亡抑制蛋白，定位于线粒体内膜、内质网膜及核膜上。有报道，Bcl-2可使细胞对紫杉醇产生抗药性，相反降低Bcl-2的水平可使细胞对紫杉醇敏感，表明Bcl-2水平与细胞对紫杉醇的耐药直接相关。研究证明VES作用于白血病细胞Raji、前列腺癌细胞后，Bcl-2蛋白表达下降，本实验VES作用于MDA-MB-453细胞有可能通过降低Bcl-2的水平使肿瘤细胞对紫杉醇敏感而产生协同作用。此外，紫杉醇将细胞阻滞于G2/M期，VES可使肿瘤细胞阻滞于G1期，协同作用有可能与两种药物作用于细胞的不同周期有关。但具体机制需要下一步研究。

［1］SHIN S J, HYJEK E, EARLY E, et al.intratumoral heterogeneity of Her-2/neu in invasive mammary carcinomas using fluorescence in-situ hybridization and tissue microarray［J］.Int J Surg Pathol, 2006, 14(4): 279-284.

［2］师以康, 张胜华, 黄云虹, 等.乳腺癌细胞的Her-2过表达降低其对紫杉醇的药物敏感性 ［J］.中国药理学通报,2009, 25(4): 444-448.

［3］LU J, TAN M, HUANG W C, et al.Mitotic deregulation by survivin in erbB2-overexpressing breast cancer cells contributes to Taxol resistance ［J］.Clin Cancer Res, 2009,15(4): 1326-1334.

［4］WANG S, HUANG X, LEE C K, et al.Elevated expression of erbB3 confers paclitaxel resistance in erbB2- overexpressing breast cancer cells via upregulation of Survivin ［J］.Oncogene, 2010, 29(29): 4225-4236.

［5］ZHOU M, LIU Z, ZHAO Y, et al.MicroRNA-125b confers the resistance of breast cancer cells to paclitaxel through suppression of proapoptotic Bcl-2 antagonist killer 1 (Bak1)expression ［J］.J Biol Chem, 2010, 285(28): 21496-21507.

［6］NEUZIL J, WEBER T, GELLERT N, et al.Selective cancer cell killing by alpha-tocopheryl succinate ［J］.Br J Cancer,2001, 84(1): 87-89.

［7］肖浩文, 叶建锋, 欧程山, 等.VES抑制Raji细胞增殖中对CDK2和Bcl-2/Bax蛋白表达的影响 ［J］.中国公共卫生,2003, 19(1): 1-3.

［8］REAGAN-SHAW S, NIHAL M, AHSAN H, et al.Combination of vitamin E and selenium causes an induction of apoptosis of human prostate cancer cells by enhancing Bax/Bcl-2 ratio ［J］.Prostate, 2008, 68(15): 1624-1634.

［9］JORDAN M A, WILSON L.Microtubules as a target for anticancer drugs ［J］.Nat Rev Cancer, 2004, 4(4): 253-265.

［10］GLIGOROV J, LOTZ J P.Preclinical pharmacology of the taxanes: Implications of the differences ［J］.Oncologist,2004, 9(Suppl 2): 3-8.

［11］MENARD S, PUPA S M, CAMPIGLIO M, et al.Biologic and therapeutic role of Her-2 in cancer ［J］.Oncogene, 2003,22(42): 6570-6578.

［12］CIARDIELLO F, CAPUTO R, POMATICO G, et al.Resistance to taxanes is induced by c-erbB-2 overexpression in human MCF-10A mammary epithelial cells and is blocked by combined treatment with an antisense oligonucleotide targeting type Ⅰ protein kinase A ［J］.Int J Cancer, 2000,85(5): 710-715.

［13］KLINE K, YU W, SANDERS B G.Vitamin E and breast cancer ［J］.J Nutr, 2004, 134(Suppl 12): 3458-3462.

［14］ISRAEL K, YU W, SANDERS B G, et al.Vitamin E succinate induces apoptosis in human prostate cancer cells: roles of Fas in vitamin E succinate- triggered apoptosis ［J］.Nutr Cancer, 2000, 36(1): 90-l00.

［15］曹选平, 王树斌, 周弘, 等.维生素E琥珀酸酯诱导舌鳞癌Tca8113细胞凋亡的研究 ［J］.华西口腔医学杂志, 2008,26(4): 362-364.

［16］WU X X, KAKEHI Y, JIN X H, et al.Induction of apoptosis in human renal cell carcinoma cells by vitamin E succinate in caspase-independent manner ［J］.Urology, 2009, 73(1):193-199.

［17］张伟, 张军初, 徐昕昀, 等.维生素E琥珀酸酯对乳腺癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用 ［J］.中国普通外科杂志, 2005,14(12): 918-921.

［18］张伟, 徐昕昀, 张军初, 等.维生素E琥珀酸酯诱导MDAMB-435乳腺癌细胞的凋亡 ［J］.肿瘤, 2006, 26(4): 318-321.