榄香烯对人肝癌HepG-2细胞增殖及拓扑异构酶Ⅰ的影响

龚敏 梁鑫淼 崔晓楠

1.大连医科大学附属第一医院肿瘤科，辽宁 大连 116011；

2.中科院大连化学物理研究所制药工程与过程化学研究中心，辽宁 大连 116023

目前治疗原发性肝癌缺乏有效的治疗药物，疗效差，易产生多药耐药，并且不良反应较大，因而探索高效低毒的抗肝癌药物历来是热点问题［1］。榄香烯(elemene，ELE )是从活血化瘀中药姜科植物温莪术中提取出的抗癌活性单体，临床应用表明，ELE对多种肿瘤具有抑制作用，表现出高效低毒的中药特质，尤其对肝癌显示出良好临床疗效［2］。然而其机制有待深入研究。DNA 拓扑异构酶Ⅰ(topoisomerase Ⅰ，TOPOⅠ)是调节核酸拓扑构型的关键酶，已成为抗癌药物研究的重要靶点之一［3］。本文探讨ELE对人肝癌HepG-2细胞增殖及TOPOⅠ表达及活性的影响，为解析ELE作用机制及探索有效的肝癌药物奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌细胞株HepG-2由大连医科大学 附属第一医院中心实验室传代、保存；ELE购自大连金港制药有限公司(批号0508031)；羟基喜树碱(hydroxycam ptothecin，HCPT)购自深圳万东药业有限公司；MTT购自Biosharp公司；PBR322DNA、TOPOⅠ和RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；PCR扩增引物由大连宝生物工程有限公司合成；碘化丙啶购自Sigma公司；溴化乙锭购自Amresco公司；TRIzol试剂盒购自Invitrogen公司；氯仿、异丙醇和乙醇均为国产分析纯。

1.2 细胞培养

将HepG-2细胞接种于含10%新生牛血清的低糖IMDM培养基中。于CO2体积分数为5%、37 ℃且饱和湿度的温箱中培养。每2 d更换1次培养基，细胞长至铺满瓶底约90%时用0.25%胰蛋白酶消化后传代。

1.3 MTT法检测肿瘤细胞的增殖

用0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的HepG-2细胞，用单纯培养液配成单个悬浮细胞(浓度为5×104/mL)，接种于96孔培养板中，每孔体积为100 μL，每组设8个复孔，另设空白组(只加培养液不加细胞，其他实验步骤保持一致，最后比色时，以空白组孔调零)。在温箱温育24 h后去原培养液，实验组分别加入ELE至200 μL/孔，使其浓度分别为20、40、60、80、100、120、140、160、180及200 μg/mL，另设对照组(培养液ELE为0)。将细胞置于培养箱中分别培养24、48及72 h。在各个时间点的前4 h每孔加入MTT液20 μL(5 mg/mL)，避光继续温育，4 h后用1 mL注射器小心吸去孔内培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，震荡6 min使结晶完全溶解，于酶标仪570 nm波长下，以空白孔调零，测定各孔吸光值(D)。按公式计算不同浓度药物对肿瘤细胞生长的抑制率(IR)及半数抑制浓度(IC50)，绘制剂量效应曲线及时效曲线。IR(%)=(D对照组-D试验组)/(D对照组-D空白组)×100%；以药物浓度为横轴，细胞抑制率为纵轴，根据量效曲线计算半数抑制浓度(IC50值)。 实验重复3次。

1.4 流式细胞术分析细胞周期

调细胞浓度至1×106/mL接种于25 cm2培养瓶中，将HepG-2细胞分为4组，分别为对照组(未加药物)和3个实验组(ELE浓度为20、40和60 μg/mL)。细胞处理后置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养48 h，0.25%的胰蛋白酶消化，离心(560×g)5 min，弃上清液，冷PBS洗2次，重悬于70%冷乙醇中，充分混匀，4 ℃固定过夜。加入25 μL RNaseA，置于37 ℃30 min，再加入25 μL PI染料，4 ℃避光静置30 min，在流式细胞仪(FACS Vantage SE)上进行周期分析。实验重复3次。

1.5 RT-PCR 检测TOPOⅠmRNA含量

取对数生长期细胞调浓度至5×105/mL接种于25 cm2培养瓶内，设立对照组(未加药物)和实验组(ELE浓度为20、40和60 μg/mL)，培养48 h后收集各组细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA(按TRIzol 抽提试剂说明书进行)。RT-PCR步骤按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0说明书进行，将RNA反转录合成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应，β-actin为内参照。TOPOⅠ引物序列为：上游引物：5’-CGCTATCCTGAAGGCATCAA-3’；下游引物：5’-CTGGAGGAGGAGAAGGAACC-3’。扩增产物为565 bp。β-actin引物序列：上游引物5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’；下游引物：5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’，扩增产物为404 bp。TOPOⅠ按以下条件进行PCR反应：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行35个循环；最后72 ℃延伸6 min。β-actin按以下条件进行PCR反应：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行30个循环；最后72 ℃终延伸5 min。将扩增的RTPCR产物在1×TAE缓冲液中1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min，电压控制在 90 V，UVP凝胶成像及分析系统观察、拍照、分析。实验重复3次。

1.6 TOPOⅠ介导的解旋作用

反应体系的组成：PBR322DNA 0.5 μg，TOPOⅠ Buffer 2 μL，TOPOⅠ 1 U(1 U定义为在标准的反应条件下使0.01 μg/μL负超螺旋PBR322完全解旋的酶量)，0.1% BSA 2 μL，不同浓度的ELE 4 μL为实验组，不同浓度的HCPT 4 μL为阳性对照组，双蒸水补足至20 μL。37 ℃温育30 min后，加入1 μL的终止液(1% SDS，50%甘油，0.05%溴酚蓝)，在1×TAE缓冲液中1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min，电压控制在136 V。电泳结束后，0.5 μg/mL溴化乙锭(ethidium bromide，EB)染色30 min，UVP凝胶成像及分析系统观察、拍照、分析。实验重复3次。

1.7 ELE对DNA的直接作用

反应体系的组成：PBR322DNA 0.5 μg，TOPOⅠ Buffer 2 μL，不同浓度的ELE 4 μL为实验组，以PBR322DNA为阴性对照组，双蒸水补足至20 μL。37 ℃温育30 min，加入1 μL的终止液(1% SDS，50%甘油，0.05%溴酚蓝)，电泳，染色及拍照同上，实验重复3次。

1.8 统计学处理

应用SPSS 11.5软件对数据进行统计分析，对符合正态分布资料的均数用表示。对多组均数比较采用单因素多水平设计定量资料的方差分析，并通Dunnett检验进行实验组与对照组的两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。［(21.47±0.59)%］(P＜0.05)，呈现剂量依赖性(图2)。

2 结 果

2.1 MTT法检测肿瘤细胞生长状态

随着药物浓度及作用时间增加，细胞增殖能力逐渐下降，表现为时间和剂量依赖性；药物作用24、48和72 h 后，IC50值分别为96.13、80.84和60.95 μg/mL(图1)。

2.2 ELE对HepG-2细胞周期的影响

药物作用48 h后，实验组(ELE浓度分别为20、40和60 μg/mL)的S期细胞比例［(42.36±3.40)%、(47.86±4.83)%和(6 0.9 5±4.6 1)%］显著高于对照组

2.3 ELE对HepG-2细胞TOPOⅠmRNA 表达的影响

药物作用48 h后，实验组(ELE浓度分别为20、40和60 μg/mL)TOPOⅠmRNA与β-actin mRNA条带灰度比值(0.84±0.08、0.68±0.01和0.58±0.04)显著低于对照组(1.10±0.06)(P＜0.05)，提示ELE可抑制TOPOⅠ转录，并呈剂量依赖性(图3)。

2.4 ELE对TOPOⅠ介导的负超螺旋PBR322DNA解旋作用的影响

TOPOⅠ切断DNA双链中的一股，使DNA双链在解链旋转中不致打结，适当时候又把切口封闭，使DNA变为松弛状态，从而可催化超螺旋的DNA松弛解旋。采用TOPOⅠ介导的负超螺旋PBR322DNA解旋作用，观察ELE对TOPOⅠ活性的影响。如图4所示，泳道1是负超螺旋PBR322DNA(supercoiled DNA，S)；泳道2是加酶反应后，超螺旋解旋成为松散型DNA(Relaxed DNA，R)；泳道3、4是为阳性对照组，在HCPT(典型的TOPO I 抑制剂)浓度为5 μg/mL时对TOPOⅠ介导的解旋反应无抑制作用，在浓度为1 μg/μL时完全抑制了TOPOⅠ对PBR322 DNA的解旋作用；泳道5是HCPT 1 μg/μL联合ELE 40 μg/mL对TOPOⅠ介导的负超螺旋PBR322DNA解旋作用的影响，如图可见抑制了TOPOⅠ的活性。泳道6～11是不同浓度的ELE对TOPOⅠ介导的负超螺旋PBR322DNA解旋作用的影响。结果表明，ELE 40、60、80和100 μg/mL组对TOPOⅠ的活性有抑制作用，扫描其光密度最大值分别为(58±3、80±6、92±10和134±12)，经统计分析显示，ELE 100 μg/mL组与40、60和80 μg/mL组相比较差异有统计学意义(P＜0.05)，ELE对TOPOⅠ的活性有抑制作用，其抑制作用具有剂量依赖性(图4)。

图 3 ELE作用于人肝癌HepG-2细胞48 h后TOPOⅠmRNA表达的变化Fig.3 TOPOⅠ mRNA expression of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells interfered by ELE for 48 h

图 4 ELE抑制TOPOⅠ介导的负超螺旋PBR322DNA的解旋作用Fig.4 Inhibition of ELE on TOPOⅠ-mediatedunwinding effect of negative supercoil PBR322DNA

2.5 ELE对负超螺旋PBR322DNA无直接抑制作用

采用负超螺旋PBR322DNA观察ELE对DNA的直接作用。结果表明，对照组及各药物组平均光密度值分别为(22 860±2 412、24 572±518、22 318±651、22 781±837、20 781±1 180和24 284±749)，各组差异无统计学意义(P＞0.05)，提示ELE不能直接引起负超螺旋PBR322DNA的双链断裂，对DNA不能产生直接的作用(图5)。

图 5 ELE对负超螺旋PBR322DNA的直接作用Fig.5 Direct effect of ELE on negative supercoil PBR322DNA

3 讨 论

原发性肝癌是人类恶性肿瘤死亡因素的重要构成，发病率与死亡率呈上升趋势，严重威胁人类健康。目前缺乏有效的治疗措施，作为化疗非敏感肿瘤，肝癌目前化疗药物有效率＜20%［4］。索拉非尼、厄洛替尼等靶向药物在肝癌中的疗效尚处临床观察阶段［5］，虽然索拉非尼是第一个被临床证实能够轻度延长肝癌患者生存期的药物，然而有效率低，不良反应有别于化学药物，临床尚处于认识阶段，因出现药物所致死亡病例，限制了索拉非尼的临床应用，探索高效低毒的抗肝癌药物是基础医学与临床医学关注的热点。

从天然药物中筛选高效低毒的抗肿瘤药物是获取抗肿瘤药物的基本策略。ELE是从我国传统中药温莪术中提取的抗癌单体，临床抗肿瘤疗效评价良好，尤其对化疗非敏感肿瘤肝癌表现出抑癌效果［6］。临床报道表明，应用ELE肝动脉栓塞治疗中晚期肝癌疗效理想，可显著抑制肿瘤生长，提高患者生存质量，并显示出生存优势，与化疗联合应用表现出协同抗肿瘤作用，并降低了化疗不良反应［7］。基础研究表明ELE能够促进肿瘤细胞凋亡，诱导细胞周期阻滞，干扰信号转导通路，抑制肿瘤转移等抗肿瘤作用［8］。然而有关ELE对TOPO的作用未见报道。

TOPO是调节核酸拓扑构型的关键酶，其催化单链或双链DNA短暂分离以利于复制。按其诱导DNA断裂机制的不同分为TOPOⅠ和TOPOⅡ(TOPOⅡα、TOPOⅡβ)两类［9］。TOPOⅠ是生物体内广泛存在的一类必需酶，参与DNA复制、转录、重组和修复等所有关键的核过程［10］。该类酶通过调节超螺旋、连锁/去连锁以及核酸解结作用，影响DNA拓扑结构［11］。TOPOⅠ是S期关键酶，对肿瘤细胞的增殖起到至关重要作用，是目前一线抗肿瘤药物如HCPT、拓扑替康及伊立替康的药效靶点，干扰TOPOⅠ表达是目前抗癌药物的重要作用机制［12］。本研究发现，ELE能够抑制人肝癌HepG-2细胞增殖，呈时间与剂量依赖性特征，并可将HepG-2细胞阻滞于S期。DNA复制是S期的主要事件，作为调节核酸拓扑构型的关键酶，TOPOⅠ在S期DNA复制过程起重要作用，因而，干扰TOPOⅠ可能影响S期细胞生命活动，导致肿瘤细胞S期阻滞，从而启动肿瘤细胞的凋亡过程。研究表明ELE能够影响肝癌细胞凋亡相关基因、热休克蛋白及其相关调控因子基因的表达，抑制肝癌细胞迁移、侵袭等［13-14］，表现为多靶位的抗肝癌作用。我们的研究首次表明干扰TOPOⅠ表达及活性可能为ELE抑制肝癌的作用靶位，ELE是值得关注的抗肝癌药物。

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