马来酸酯类物质的合成及其抑菌活性研究

芮云锋，陈小龙，熊智强，李 伟

(浙江工业大学，浙江 杭州 310032)

油菜菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)也称为油菜核盘菌，是一种世界性病原真菌［1］。在中国，油菜菌核病居油菜3大病害之首，重病年减产达50%，严重影响了我国的油菜生产［2］，虽然国内外在该病害的发生和流行规律及预测预报等方面做了大量的研究工作［3-4］。在药剂和农业栽培措施防治等方面也取得了一定的成绩，但仍未从根本上改变油菜菌核病严重危害的局面［5］。

马来酸酐结构天然化合物是一类由微生物产生的物质，已报道的该类化合物绝大部分都具有良好的生物活性，特别是杀菌活性［6］。比如变构霉素，抗真菌效果明显，尤其对油菜菌核病 (EC50=0.5 μg·mL-1)［7］。本课题组发现由马来酸酐结构为先导的合成含马来酸酯类结构的化合物也有较好的抑菌活性，尤其对真菌的抑制效果良好，特别是马来酸乙丙酯，对油菜菌核病菌的半抑制浓度和最小抑制 浓 度 分 别 为 278.90 μg·mL-1、480.61 μg·mL-1［8］。马来酸酯类化合物本身具有合成工艺简单，原料便宜，对人体毒副作用小等优点。马来酸酯类物质含马来酸酐结构，在医药和食品防霉等方面已成功应用，本课题组合成变构霉素等含马来酸酐结构的化合物对油菜菌核病菌的抑制效果良好。本研究合成了一批含马来酸酐结构的马来酸酯类物质，并检测其对油菜菌核病菌的抑制活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 化合物

马来酸酐购于国药集团化学试剂有限公司，分析纯。甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、浓硫酸、硫酸氢钠、无水硫酸钠、碳酸氢钠等试剂购于本地试剂供应商，分析纯。

1.1.2 供试菌株

油菜菌核病菌 (Sclerotinia scerotiorum)，浙江省农业科学院提供。

1.1.3 培养基

PDA培养基:去皮马铃薯200 g切成小块，500 mL水煮沸30 min，过滤液中加葡萄糖20 g，琼脂条20 g，加热溶化，加蒸馏水至1 000 mL，pH值自然，分装，121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 马来酸单酯类化合物的合成

马来酸酐和过量的醇一起装在三角瓶中，振荡反应3 h，真空旋转蒸发去除多余的醇类，得到马来酸单酯，加无水硫酸钠干燥保存。反应过程中用薄板层析来检测马来酸单酯的反应进程，展开剂为丙酮︰三氯甲烷1∶3。该反应过程中马来酸酐开环结合一分子水，因此反应较迅速，也无需催化剂(图 1)。

1.2.2 马来酸二酯类化合物的合成

图1 马来酸单酯的合成

马来酸单酯与过量的醇一起放入烧杯中，在浓硫酸或硫酸氢钠等催化剂的催化作用下，回流反应3 h，真空旋转蒸发除去多余的醇类和反应产生的水，得到的马来酸二酯用5%的碳酸氢钠溶液萃取去除酸性催化剂，加无水硫酸钠干燥保存。反应过程中用薄板层析来检测马来酸二酯的反应进程，展开剂为丙酮︰三氯甲烷1∶3(图2)。

图2 马来酸二酯的合成

1.2.3 菌种活化

将浙江省农业科学院提供的油菜菌核病(Scleotinia sclerotiorum)菌株进行活化，用打孔器将保藏的油菜菌核病菌转接到倒有PDA培养基的培养皿上，置于25℃恒温箱中培养2～3 d，冰箱保存待用。

1.2.4 各马来酸酯类化合物对油菜菌核病菌的最小抑制浓度 (MIC)测定

将合成的各马来酸酯类化合物分别稀释至10、50、100、500、1 000 mg·mL-1等不同浓度，121℃，20 min灭菌。

在无菌条件下，移取1 mL各浓度马来酸酯类化合物加入培养皿中，趁热倒入熔化的PDA培养基9 mL于上述培养皿中，混匀后冷却。用打孔器将活化的菌核病菌转接到培养皿上，置于25℃恒温箱中培养。

每隔12 h观察培养结果，记录抑菌圈的大小。按上述方法对浓度梯度适当调整，直到找到MIC。

1.2.5 各马来酸酯类化合物的生物活性测定

在无菌条件下，分别取1 mL各浓度的马来酸酯类化合物加入培养皿中，趁热倒入熔化的PDA培养基9 mL于上述培养皿中，混匀后冷却，以无菌水为空白对照。

凝固后，用同一个打孔器分别移接生长一致的菌块，菌丝面朝下，置于培养皿中央。每皿接1个菌块，每次做3个平行样。于25℃恒温箱中培养。48 h后测量菌落直径，十字交叉，取两次数据平均值，并计算抑菌率。

抑菌率/%=(对照菌落纯生长量-处理菌落纯生长量)/对照菌落纯生长量×100。

菌落纯生长量/mm=2次直径平均值 -菌块直径。

然后以合成的各马来酸二酯类化合物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，确定EC50和MIC。

2 结果与分析

2.1 马来酸酯类物质的合成

本实验以马来酸酐为起始原料，化学合成了马来酸单甲酯、马来酸二乙酯、马来酸甲丙酯、马来酸乙丁酯等14种马来酸酯类物质 (图3)。

2.2 合成反应时间对马来酸单酯类物质合成的影响

在马来酸单酯类物质的合成过程中，反应时间的长短直接影响了合成的效果，实验中以马来酸单乙酯为标本来确定马来酸单酯类物质的最佳反应时间。取6份5 g马来酸酐和20 mL无水乙醇于28℃、100 r·min-1条件下分别反应 1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h，反应结束后得到的马来酸单乙酯分别为:6.86 g、7.49 g、8.01 g、8.34 g、8.48 g、8.48 g。

以上数据结合薄板层析，可知马来酸单乙酯在3 h后已经反应完全，因此，我们在以后的实验中合成马来酸单酯类物质的反应时间都设定为3 h。

2.3 马来酸酐和醇的数量关系对马来酸单酯类物质合成的影响

在马来酸单酯的合成中，马来酸酐和醇类的数量关系将影响合成效果，实验中以马来酸单乙酯的合成为标本来确定反应中马来酸酐和醇类的数量关系。在1 mol无水乙醇中分别加0.3 mol、0.5 mol、0.7 mol、0.9 mol 、1.0 mol、1.1 mol、1.2 mol、1.3 mol等8种不同摩尔数的马来酸酐，反应3 h后得到的马来酸单乙酯的量分别为:0.25 mol、0.37 mol、0.57 mol、0.82 mol、0.87 mol、0.91 mol、1.23 mol、1.35 mol。

观察以上数据可知，马来酸单乙酯的量随着马来酸酐的量的增加而增加。但是，实际实验中马来酸酐超过1.0 mol的3个烧瓶中残留有未溶的马来酸酐，而且马来酸酐能溶于无水乙醇，用薄板层析法可以发现，部分马来酸酐只是溶解在无水乙醇中，并未参加反应。考虑到最佳反应效果和经济效率，实验采取醇过量的方法，在以后的实验中醇和马来酸酐的摩尔比都设定为1∶0.9。

图3 合成的各种马来酸酯类物质

2.4 马来酸酯类化合物对菌核病菌的抑制作用

加有各浓度的马来酸酯类物质的油菜菌核病菌放于25℃恒温箱中培养，48 h后测量菌落直径，计算抑菌率，作图确定半抑制浓度 (EC50)和最小抑制浓度 (MIC)，结果见表1和表2。

表1 马来酸单酯类物质的半抑制浓度 (EC50)和最小抑制浓度 (MIC)

从以上数据可以得出，马来酸单酯类物质对油菜菌核病菌的抑制效果基本上是随着酯键上碳链的伸长而增加。其中，马来酸单丙酯的半抑制效果最好，EC50=479.61 μg·mL-1，马来酸单丁酯的最小抑制效果最好，MIC=1 073.80 μg·mL-1。

表2 马来酸二酯类物质的半抑制浓度 (EC50)和最小抑制浓度 (MIC)

以上数据可以得出，马来酸二酯类物质对油菜菌核病菌的抑制效果基本上也是随着酯键上碳链的伸长而增加。其中，马来酸乙丙酯的抑菌活性最好，EC50=278.90 μg·mL-1，MIC=480.61 μg·mL-1。

比较表1和表2我们认为，马来酸二酯类物质对油菜菌核病菌的抑制效果普遍比马来酸单酯类物质要好。

3 小结与讨论

关于马来酸酯类物质的合成研究较多，如王天贵等［9-11］前后3次研究过马来酸二甲酯的合成新工艺，虞丹等［12］研究过酸性功能化离子液体催化合成马来酸二乙酯。但国内外学者仅限于单个马来酸酯类物质的研究，本实验首次成批合成马来酸酯类物质，并首次把马来酸酯类化合物应用于防治油菜菌核病害［8］。研究结果表明，实验中化学合成的14种马来酸酯类化合物均有抑油菜菌核病菌效果。目前世界上已报道的马来酸酐类天然化合物只有27个，其中大部分都具有十分良好的杀菌活性［13］，结合我们的研究，可以推测马来酸酐结构是这些化合物具有良好杀菌活性的基础。

目前，马来酸酯类物质在医药和食品防霉方面已成功应用。段保民［14］用富马酸单甲酯做食品防腐剂，樊素芳等［15］合成了新型食品饲料防霉剂富马酸二甲酯，以上工作显示了马来酸酯类物质是一类低毒或无毒、易被环境降解的化合物，因此有望进一步开发出一类极具应用价值的新型抗菌核病的农药，有开发成为绿色农药的前景。

本研究只是初步探讨了马来酸酯类物质的抑菌活性，也只对油菜菌核病菌的抑菌效果做了研究，还可对其他菌种做相关抑菌实验。本实验对马来酸酯类物质的抑制机理没有深入研究，在研究菌核病菌的生长曲线，分析具体抑制机理过程中，还可对含马来酸酯类化合物进行结构上的改造，分析其区别所在，找到抑菌效果更佳的马来酸酯类物质或其衍生物。

［1］ Boland G J，Hall R. Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum ［J］.Plant Pathol，1994，(16):93-108.

［2］ 张夕林，孙雪梅，张谷丰，等.油菜菌核病抗药性监测与综合治理技术的研究 ［J］.农药科学与管理，2003，24(6):145-149.

［3］ 张彭湃.微生物菌种选育技术的发展与研究进展 ［J］.生物学教学，2005.30(9):3-5.

［4］ 廖晓兰，罗宽.油菜花上细菌的分离及其对菌核菌的拮抗作用 ［J］.湖南农业大学学报，2000，26(4):202-211.

［5］ 朱小惠，陈小龙.油菜菌核病的致病机理和生物防治［J］.浙江农业科学，2010，5:1035-1038.

［6］ Xiaolong Chen，Yuguo Zheng and Yinchu Shen Natural products with maleic anhydride structure:Nonadrides，tautorrIycin， chaetomdlic aahyaride， and other compounds［J］，Chem Rev，2007，107:1777-1830.

［7］ Cheng XC，Kihara T，Kusakabe H，et al.A new antibiotic，tautomycin. Journal of Antibiotics， 1987， 40 (6):907-909.

［8］ 陈小龙，芮云锋.顺丁烯二酸酯类化合物对油菜菌核病菌的抑制 ［P］.201010122276.9，2010.

［9］ 王天贵，余锡孟.马来酸二甲酯合成新工艺研究:I催化剂制备 ［J］.化学工程师，2010，173(2):8-12.

［10］ 王天贵，李强，余锡孟.马来酸二甲酯合成新工艺研究:II酯化反应条件研究 ［J］.化学工程师，2010，174(3):3-6.

［11］ 王天贵，李强，余锡孟.马来酸二甲酯合成新工艺研究:III:铁、镁改性沸石催化酯化反应研究 ［J］.化学工程师，2010，175(4):13-16.

［12］ 虞丹，郭红云.酸性功能化离子液体催化合成马来酸二乙酯 ［J］.工业催化，2009，17(8):62-65.

［13］ 金侃华，陈小龙.含顺丁烯二酸酐结构化合物抑制黑曲霉性能的研究 ［J］.安徽农业科学，2009，37(21):9857-9858.

［14］ 段保民.新食品防腐剂富马酸单甲酯的制备 ［J］.应用化工，1990(1):40-41.

［15］ 樊素芳，徐翠莲，王彩霞，等.新型食品饲料防霉剂富马酸二甲酯的一锅合成法 ［J］.郑州粮食学院学报，2000，21(2):38-40.