葛根素对STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜的保护作用及机制研究

陈 放，刘开扬，徐 珊，吕伟红，程 宏，张洪泉

(扬州大学1.临床医学院眼科，2.医药研究所，3.医学院生化教研室，江苏扬州 225001)

糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，已成为目前世界范围内致盲的主要眼病。由于病因和发病机制复杂，目前DR治疗效果不尽如人意。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)被认为在糖尿病视网膜病变的发生中起重要作用［1-2］。慢性高血糖引起机体蛋白质非酶糖化所形成的AGEs在视网膜组织内大量堆积［3］，通过作用于细胞上的特异性AGEs受体(RAGE)，激活多个信号传导通路，最终引起DR。因此，抑制AGEs形成或阻断AGE与其受体相互作用可能延缓糖尿病视网膜病变的发生发展［4］。葛根素(puerarin，Pue)为葛根干燥根中提取得到的一种单体异黄酮类有效成分，化学名为 8-β-D 吡喃葡萄糖-4'，7'-二羟基异黄酮苷，其分子式为C21H20O9。葛根素具有扩张冠状动脉、降血脂、降血糖、改善微循环等药理作用，现已广泛用于治疗心血管疾病、糖尿病等。体外实验已表明，葛根素具有抑制蛋白非酶糖基化的作用，且葛根素在抑制AGEs产生的同时减少AGEs对牛视网膜微血管周细胞的损伤［5］。Shen等［6］观察到葛根素对糖尿病大鼠肾脏、主动脉AGEs和RAGE的水平有明显的抑制作用。但有关葛根素对视网膜AGEs的影响未见报道。本实验以STZ诱导糖尿病大鼠模型，从抑制蛋白非酶糖基化途径探讨葛根素对糖尿病大鼠视网膜的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物♂40只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠，鼠龄为8～10周，体质量200～230 g，眼部检查无异常，由浙江省实验动物中心提供。

1.2试剂与仪器葛根素(puerarin，纯度 ＞99.8%)由南京正大天晴制药公司提供;链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购于 Sigma公司;兔抗大鼠RAGE抗体、兔抗VEGF抗体均购于Cell Signalling公司;羟脯氨酸检测试剂盒购于南京建成生物公司;手术显微镜(SM-2000J):苏州六六视觉医疗设备有限公司;RT-PCR仪:Bio-Rad公司;荧光分光光度计:北京万拓公司。

1.3方法

1.3.1DM大鼠模型的复制与分组随机分为正常对照(Control)组(10只)和DM制模组(30只)。参照文献方法［7］，DM 制模组每鼠左下腹腔注射STZ 60 mg·kg-1。72 h后取鼠尾血测血糖，并用尿糖试纸测尿糖。随机血糖浓度≥16.65 mmol·L-1，尿糖在⧺～⧻者即为成模大鼠。然后将成模大鼠随机分为糖尿病对照(DM)组、DM+葛根素低剂量组(Pue1组)、DM+葛根素高剂量组(Pue2组)，每组10只。葛根素低、高剂量组分别应用葛根素250、500 mg·kg-1治疗［7］，每日 1 次，采用经食道灌胃给药，Control组、DM组不予任何药物治疗，每日每只灌3ml灭菌水。自造模成功起，连续给药4周。实验期间自由进水、进食，不使用胰岛素及其他降糖药物。

1.3.2标本收集实验期间，各组大鼠每周测1次体重、血糖，观察大鼠全身一般情况及眼部情况。给药4周后，1%戊巴比妥钠(0.4 mg·kg-1)大鼠腹腔注射麻醉。小心、迅速摘除双眼眼球。取好标本后，过量麻醉处死动物。一眼眼球置于固定液中，用于光学显微镜检查;另一眼于存有生理盐水的玻璃皿中去除眼前节及玻璃体，在手术显微镜下钝性分离视网膜组织，用于测定AGEs含量或-80℃储存以待分子生物学检测。

1.3.3组织病理学观察眼球摘取后迅速置入10%中性福尔马林固定液中，24 h后作经视盘的矢状切片，梯度浓度乙醇脱水、石蜡包埋、切片(片厚5 μm)、苏木精素和伊红染色、光学显微镜下观察并摄片。

1.3.4视网膜AGEs测定用荧光法测定AGEs的含量［8］。将视网膜组织加 PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.4)4 ml，以超声波匀浆器匀浆60 s，于4℃离心，6 000 r·min-1×30 min。沉淀物用去离子水洗3次，然后加氯仿-甲醇(2∶1)5 ml，4℃振荡过夜。再加入2 ml甲醇及0.5 ml水，离心，沉淀物再用甲醇洗3次，去离子水洗 3次(水化、冲洗)。再用HEPES缓冲液(pH 7.5，0.1 mmol·L-1CaCl2)洗2次，沉淀物于5 ml缓冲液中，4℃过夜。离心去缓冲液，将沉淀物悬浮于1.0 ml包含Ⅴ型胶原酶(290 U)的HEPES缓冲液中，加入防腐剂(甲苯、氯仿各2 μl)。以含HEPES缓冲液及胶原酶作为空白标准管，37℃振荡消化 24 h。离心3 000 r·min-1×3 min，留取上清消化液，于消化液中加蒸馏水1 ml，避光静置1 h。用荧光分光光度计在370/440 nm(发射波长/激发波长)处测定其荧光强度。消化液中羟脯氨酸含量用氯胺T法测定。AGEs含量以每mg羟脯氨酸所含的荧光强度为一个任意单位(Arbitrary Unit)，用AU表示。

1.3.5Real Time PCR检测大鼠视网膜组织加Trizol 0.5 ml用电动匀浆器冰上充分匀浆，室温放置5 min，使其充分裂解。从大鼠视网膜组织中分离出RNA合成cDNA。运用PCR分析RAGE、VEGF基因表达水平。大鼠特异的引物如下:RAGE(sense)，5'AGGCTCTGTGGATGGGTCTGG3';RAGE(antisense)，5'CATGGATCATGTGGGCTCTGG3';VEGF(sense)，5'GTGGACATCTTCCAGGAGGAGTA3';VEGF(antisense)，5'CTCTGAACAAGGCTCACAGT3'。所有反应都按照操作程序进行，反应条件是:50℃ 2 min，95℃ 10 min，然后95℃ 15 s、60℃ 1 min，循环40次。每一样品试验3次，结果取平均值。β-actin作为参照，其引物序列为(sense)5'-GCACCGCAAATGCTTCTA-3';(antisense)5'-GGT CTTTACGGATGTCAACG-3'。最终结果计为与对照组进行比较后的相对值，对照组设置为1。

1.3.6Western blot检测取视网膜组织，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂(百泰克公司)，提取蛋白质;检测蛋白质浓度，各样本稀释成统一浓度，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳;电泳后转移到硝酸纤维素膜上，并用含5%脱脂牛奶的 TBST(0.05%Tween-20)封闭1 h，然后分别用抗RAGE抗体(1∶1 000稀释，Cell Signaling公司)、抗 VEGF抗体(1∶1 000稀释，Cell Signaling公司)及抗 β-actin抗体(内参，1∶3 000稀释，Santa Cruz公司)4℃孵育过夜;洗膜后用1∶5 000稀释的二抗(偶联有HRP，博士德公司)室温孵育2 h，洗膜后，将膜浸没于配置好的ECL超敏感光混合液(普利莱公司)，计时3 min，暗室中采用X线片压膜发光;经显影及定影获得结果，并采用Bio-Rad公司Quantity one软件分析结果。

1.3.7统计学方法应用SPSS软件数据进行统计学处理。所有数据以±s表示，多组间均数比较采用方差分析。

2 结果

2.1大鼠一般情况实验期间正常对照组大鼠行动活跃，饮食正常，毛色光滑，无多饮、多食、多尿现象，体重增长明显。DM组大鼠出现行动缓慢、毛色灰暗，多饮、多食、多尿与体重减轻。Pue1、Pue2组大鼠“三多一少”症状有所缓解。Pue治疗组大鼠空腹血糖较治疗前及DM组均明显降低(P＜0.05)，其中Pue2组降低血糖作用较强(P＜0.01)，但仍高于正常对照组(P＜0.05)。说明葛根素尤其是高剂量组具有一定降低血糖的作用，但尚不能使血糖恢复到正常大鼠的水平(Tab 1)。

2.2视网膜组织学改变给药后4周，正常对照组大鼠视网膜各层细胞层次分明，细胞结构紧密。DM组大鼠神经视网膜厚度明显变薄，尤其是外核层，其厚度明显薄于正常对照组。Pue治疗后较DM组有所好转，尤其高剂量Pue组外核层细胞厚度比DM组明显增厚，但较正常对照组仍薄(Fig 1)。

Tab 1 Influence of puerarin on fasting blood glucose in diabetic rats induced by streptozotocin(mmol·L-1，±s，n=10)

Tab 1 Influence of puerarin on fasting blood glucose in diabetic rats induced by streptozotocin(mmol·L-1，±s，n=10)

*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM

Group 0 wk 1 wk 2 wk 3 wk 4 wk Control 4.98±0.37 4.62±0.13 5.12±0.44 5.23±0.42 6.32±0.50 DM 29.52±3.14* 29.92±2.70* 30.25±2.86* 30.03±3.90* 29.97±2.27*Pue1 28.63±3.35 27.39±2.81*# 29.02±5.36* 27.20±3.67*# 25.85±3.35*#Pue2 28.46±3.02 27.9±1.57*# 25.11±1.79*# 25.69±2.03*## 23.51±2.31*##

Fig 1 Influence of puerarin on histopathologic changes of retina in rats on 4th week

2.3视网膜VEGF表达RT-PCR检测结果显示，给药4周时，DM组大鼠视网膜中VEGF的mRNA表达水平即明显高于正常对照组(P＜0.01);Pue1、Pue2组VEGF的mRNA表达水平均明显下降，与DM组相比差异有显著性(P＜0.01)，与正常对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)(Fig 2)。Western blot检测结果显示，VEGF的蛋白表达在正常对照组视网膜组织中表达较低。DM组视网膜组织中VEGF的蛋白表达明显高于正常对照组 (P＜0.05)。而不同剂量葛根素干预后表达均明显下降，与DM组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，接近于正常对照组(P＞0.05)(Fig 3)。

2.4视网膜内AGEs含量造模4周的糖尿病大鼠视网膜内AGEs水平(9.38±0.41)AU·mg-1Pro，较正常对照组(3.08±0.42)AU·mg-1·Pro明显上调(P＜0.05)。低剂量葛根素对AGEs的形成影响不大(7.67±0.38)AU·mg-1Pro。高剂量葛根素干预能抑制AGEs形成(6.62±0.51)AU·mg-1Pro，与DM组相比差异有显著性(P＜0.05)，但与正常对照组相比仍偏高(P＜0.05)。

Fig 2 VEGF mRNAs quantified by using RT-PCR

Fig 3 Representative Western blot analysis of VEGF expression in rat retina

2.5视网膜RAGE表达RT-PCR检测结果显示，DM组中RAGE的mRNA表达水平高于正常对照组(P＜0.01)。低剂量葛根素组RAGE的mRNA表达水平下降不明显，与DM组相比差异无显著性(P＞0.05)。高剂量葛根素干预组RAGE的mRNA表达水平明显下降，与DM组相比差异有显著性(P＜0.01)，与正常对照组无明显差异(P＞0.05)(Fig 4)。Western blot检测结果显示，RAGE蛋白表达在正常对照组视网膜组织中较低。DM组视网膜组织中表达明显高于正常对照组 (P＜0.05)。低剂量葛根素组RAGE的蛋白表达水平下降亦不明显，与DM组相比无差异(P＞0.05)。高剂量葛根素干预组RAGE蛋白表达明显下降，低于 DM组(P＜0.05)，接近于正常对照组(P＞0.05)(Fig 5)。

3 讨论

本研究中STZ诱导的糖尿病大鼠发病4周时，出现了视网膜尤其是外核层厚度的变化，这与其他学者的报道是一致的［8］。高剂量葛根素干预后糖尿病大鼠视网膜外核层厚度较DM组明显增加。我们首先从形态学证实了全身使用葛根素对早期糖尿病大鼠的视网膜神经元的确有保护作用，可延缓糖尿病大鼠视网膜病变的出现。

大量的研究已表明VEGF在DR的发生发展中扮演非常重要的角色，并且可能参与DR发生发展的各个环节。在正常视网膜组织中VEGF表达很低，在糖尿病时视网膜组织中VEGF表达增高，导致一系列的反应，包括视网膜血管渗漏、刺激视网膜内皮细胞增殖和迁移，促进新生血管形成，引起严重的并发症。目前VEGF水平被作为判断DR发展严重程度及预后的指标，亦是防治DR的重要靶点，抑制VEGF的产生可以延缓DR病变的发生发展［9］。本研究中造模后4周糖尿病大鼠视网膜的VEGF mRNA和蛋白水平均已明显升高，不同剂量葛根素干预后其表达水平均明显降低，再次提示葛根素对糖尿病大鼠的视网膜具有一定的保护作用。

Fig 4 RAGE mRNAs quantified by using RT-PCR

Fig 5 Representative Western blot analysis of RAGE expression in rat retina

本研究结果显示，葛根素虽然有一定降血糖的作用，但其降血糖作用是有限的，即使是高剂量的葛根素亦不能使血糖降至正常水平，但它可使视网膜VEGF水平基本降至正常。这提示我们葛根素对视网膜的保护作用可能与其降低血糖的作用不直接相关，而是通过其他机制来抑制VEGF表达。

体内外实验已表明，葛根素具有抑制蛋白非酶糖化的作用，而晚期糖基化终末化产物(AGEs)已被认为与糖尿病视网膜病变的发生密切相关。AGEs特异性受体(RAGE)属免疫球蛋白超家族的细胞表面分子，在许多细胞表面都低水平表达，可结合并内吞AGEs使其降解。在糖尿病、氧化应激等病理条件下，RAGE表达可明显增高［3］。本研究显示造模4周时，糖尿病大鼠视网膜中AGEs含量明显高于正常对照组，RAGE表达亦明显增高，证实了AGEs及其受体在DR发生、发展过程中具有一定作用。高剂量葛根素干预后，可抑制视网膜 AGEs形成，RAGE表达较糖尿病组亦明显减少。本研究首次报道了葛根素对糖尿病大鼠视网膜AGE-RAGE的抑制。葛根素阻断机体内蛋白糖基化的可能途径:一是有效降低血糖浓度，二是特异性阻断AGE-RAGE的结合。高血糖是引起蛋白非酶糖化的直接因素，并且蛋白非酶糖化的程度随着血糖的升高而加重。降低血糖最直接的效应是减少早期蛋白非酶糖基化产物的形成，从而阻止AGEs的产生，并抑制其与受体的相互作用。本实验结果显示葛根素可降低糖尿病大鼠的血糖，又可阻止蛋白糖基化的进程，减少AGEs的形成，下调RAGE过度表达，提示葛根素可能通过抑制视网膜AGE-RAGE途径来减轻早期糖尿病大鼠的视网膜病变。

AGEs在体内导致DR发生的具体机制尚不清楚。许多证据证明RAGE是AGEs的特异性信号转导受体，它和AGEs配对激活血管炎症反应和相关基因的表达，导致糖尿病视网膜病变的发生发展［10］。目前研究认为，AGEs与其受体RAGE结合后，可诱导产生氧化应激，生成大量氧自由基，激活p21ras/MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)，进而激活多种炎症相关基因的调控枢纽转录因子核因子NF-κB，从而导致视网膜周细胞的凋亡、增加白细胞黏附、聚集及活化、促进 VEGF的表达等［11］。有学者［12］发现 AGE可使 VEGF mRNA的表达明显增加，且增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)患者玻璃体VEGF和AGE含量均明显高于非糖尿病患者，VEGF与AGE呈正相关。AGE通过增加VEGF的产生而参与DR的发生发展。在我们之前的研究中已证实葛根素可抑制DM大鼠视网膜NF-κB的活化［13］，这提示我们葛根素可能通过抑制AGEs形成和RAGE的表达，从而抑制NF-κB的激活，阻断了NF-κB所诱导的细胞因子表达的反应链，间接抑制了视网膜VEGF的表达，起到保护糖尿病大鼠视网膜的作用。具体的信号传导通路有待于进一步的研究。

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