软脂酸诱导的HepG2细胞糖脂代谢紊乱及机制研究

龚受基，刘仲华，黄建安，王丽丽，杨新河，4

(1.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，2.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南长沙 410128;3.桂林医学院基础医学院，广西桂林 541004;4.孝感学院生命科学技术学院，湖北孝感 432000)

胰岛素抵抗是糖尿病发病机制之一，而肝脏胰岛素抵抗是引起2型糖尿病的重要因素［1］。总胆固醇(TC)和总甘油三酯(TG)在肝脏中的沉积会引起机体胰岛素抵抗。HepG2细胞株较好的保留了肝细胞的多种生物学特性，具有和人类肝脏相似的代谢能力，能够多代遗传，并且能够表达多种影响糖脂代谢相关酶的基因，是体外研究糖脂代谢、胰岛素抵抗的经典细胞模型［2］。

在正常情况下人体血清自由脂肪酸含量较低［3］，而高浓度自由脂肪酸可以导致肝脏脂肪沉积，从而引发胰岛素抵抗，但目前对自由脂肪酸产生胰岛素抵抗的机制研究并不深入，分子机制也不明确［4］。本实验考察软脂酸(palmitate)对 HepG2细胞糖脂代谢的影响，研究影响糖脂代谢相关基因的表达，探讨自由脂肪酸产生胰岛素抵抗的机制，期待能够阐明某些产生胰岛素抵抗的原因。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器HepG2细胞株购于上海生命科学研究院;PCR引物，生工生物工程(上海)有限公司合成;盐酸二甲双胍，寿光富康制药有限公司产品;辛伐他丁，湖北丝宝药业有限公司产品;多功能酶标仪 Varioskan Flash，Thermo Fisher Scientific产品;Rotor Gene-Q荧光定量PCR仪，Qiagen产品。

1.2方法

1.2.1细胞培养HepG2细胞培养于5%CO2、37℃环境中，培养基为含10%胎牛血清的低糖(5.55 mmol·L-1)DMEM。选取4～15代细胞，于70%～80%融合度时，经0.25%胰酶消化后分散成5×108·L-1细胞悬液，接种于细胞培养板。

1.2.2TC/TG测定HepG2细胞以软脂酸或药物处理，弃培养基，PBS洗涤3次，收集细胞。将细胞冻融3次，超声波辅助裂解，直至细胞悬液澄清［5］，按试剂盒操作测定吸光度，计算总胆固醇、甘油三酯含量，结果用每g总蛋白中的总胆固醇、甘油三酯量表示(mmol·g-1Pro)。总蛋白含量用BCA方法测定。

1.2.3糖原含量测定按文献方法测定糖原含量［6］。细胞内糖原含量(g·g-1Pro)=样品光密度值/标准光密度值×标准品糖原含量(g·g-1Pro)。

1.2.4荧光PCR检测基因表达经软脂酸诱导或药物处理的 HepG2细胞，按试剂盒操作提取总RNA，并逆转录，荧光定量PCR扩增检测目标基因表达，各组间相对基因表达用2-△△Ct表示。

1.3统计学处理实验数据采用¯x±s表示，用SPSS11.5统计软件进行统计分析，组内采用单因素分析，组间采用t检验分析。

2 结果

2.1软脂酸对HepG2细胞脂质累积的影响不同浓度软脂酸诱导HepG2细胞16 h后，低浓度软脂酸引起TC和TG累积较低，但在软脂酸浓度达到0.08 mmol·L-1时，TG 生成量升高，TC 则在 2.0 mmol·L-1浓度时，才出现升高。见Fig 1。

Fig 1 Level of cholesterol and triglyceride in palmitate-induced HepG2 cells for 16h in different concentrations

2.2软脂酸影响HepG2细胞糖原与脂质累积与时间的关系用软脂酸(0.4 mmol·L-1)分别诱导HepG2 细胞 8、16、24、32、40 h，在 24 h 内 TC 和 TG累积呈上升趋势，并在24 h达到最大值，然后下降。在第16 h糖原累积达到最大，随后呈现逐步降低的趋势。见Fig 2。

Fig 2 Level of glycogen and lipid in palmitate-induced HepG2 cells in different hours

2.3二甲双胍(metformin)和辛伐他丁(simvastatin)对软脂酸诱导HepG2细胞脂质代谢的影响二甲双胍(2.0 mmol·L-1)和辛伐他丁(0.02 mmol·L-1)均能有效降低由软脂酸(0.4 mmol·L-1)诱导引起的TC和TG升高，分别降低TC 22.19%和21.93%，降低TG 21.52%和17.72%。见Fig 3。

Fig 3 Effect of metformin and simvastatin on TC and TG in palmitate-induced HepG2 cells

2.4metformin和simvastatin对软脂酸诱导HepG2细胞糖原累积的影响软脂酸(0.4mmol·L-1)诱导细胞中糖原累积降低，二甲双胍(2.0mmol·L-1)和辛伐他丁(0.02mmol·L-1)能够抑制这种作用，提高糖原累积，恢复到接近正常水平。见Fig 4。

Fig 4 Effect of metformin and simvastatin on glycogen in palmitate-induced HepG2 cells

2.5metformin和simvastatin对软脂酸诱导HepG2细胞糖脂代谢相关基因的影响高浓度软脂酸(0.4mmol·L-1)能够抑制 AMPKα-2表达，AMPK活性剂二甲双胍能高效逆转这种抑制作用，而辛伐他丁对软脂酸抑制的AMPKα-2没有逆转作用。见Fig 5。

Fig 5 Effect of metformin and simvastatin on AMPKα-2 mRNA in palmitate-induced HepG2 cells

软脂酸(0.4mmol·L-1)诱导会导致糖代谢相关基因异常，下调GLUT2、G6pase mRNA表达，上调PEPCK mRNA表达;二甲双胍(2.0 mmol·L-1)和辛伐他丁(0.02 mmol·L-1)能够逆转这种作用，使其恢复到接近正常水平。辛伐他丁对GLUT2 mRNA的逆转作用强烈，相对值达到正常值的4.45倍。见Fig 6。

Fig 6 Effect of metformin and simvastatin on glucose metabolism genes in palmitate-induced HepG2 cells

软脂酸(0.4mmol·L-1)诱导会引起脂质代谢相关基因的异常，下调HL、SREBP1 mRNA表达，上调ACC2 mRNA表达，二甲双胍(2.0mmol·L-1)和辛伐他丁(0.02 mmol·L-1)能够高效逆转 HL、ACC2 mRNA表达，但对ACC2、SREBP1 mRNA异常没有逆转作用。见Fig 7。

3 讨论

AMPK是真核生物中的信号传感器，能反映生物体内的能量平衡与代谢平衡。软脂酸能够促进HepG2细胞中的脂质堆积，与其抑制AMPKα-2的表达有关系，还可能与抑制AMPK(Thr172)磷酸化有关。AMPK活化剂二甲双胍能逆转这种抑制作用，促进下游基因的调整，降低脂肪堆积，增加糖原累积。见Fig 8。

Fig 7 Effect of metformin and simvastatin on lipid metabolism genes in palmitate-induced HepG2 cells

Fig 8 Relation between glucose and lipid metabolism and energy

GLUT2是肝细胞表面的主要葡萄糖转运子，介导胞外的葡萄糖入胞，软脂酸抑制HepG2细胞中GLUT2 mRNA表达，降低GLUT2转运葡萄糖通过细胞膜，下调肝细胞的糖代谢功能［7］。二甲双胍能够改善GLUT2 mRNA低表达，使其表达上调，辛伐他丁则大幅度上调GLUT2 mRNA的表达。

PEPCK介导糖异生，是糖异生的一个关键酶，其表达升高会导致肝糖原异生，使肝糖输出增加［8］，肝糖原累积会减少。软脂酸升高PEPCK mRNA表达，促进肝糖输出，升高血糖，诱发胰岛素抵抗。二甲双胍和辛伐他丁都能够降低PEPCK mRNA表达，抑制肝糖原异生，有利于改善血糖水平。

软脂酸通过抑制 AMPKα-2 mRNA表达，调整HL mRNA的表达以抑制HepG2细胞内肝脂肪酶HL活性，减少对脂肪的分解作用，有利于脂肪在HepG2细胞内的堆积。二甲双胍通过AMPKα-2上调HL mRNA表达，促进脂肪分解。辛伐他丁为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)抑制剂，能够抑制HMGR表达，阻断TC的合成，同时也上调HL mRNA表达，促进脂肪分解，从而调节糖脂代谢。

SREBP1主要作用是激活参与脂肪酸与甘油三酯代谢酶乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)和脂肪酸合成酶(FAS)基因表达。高浓度软脂酸抑制SREBP1 mRNA表达，从而下调下游基因表达，降低脂肪的分解，增加脂肪在HepG2细胞中的堆积。本实验中二甲双胍和辛伐他丁都没能逆转软脂酸对SREBP1的抑制作用，说明二甲双胍和辛伐他丁改善HepG2细胞内脂肪堆积可能不是通过SREBP1起作用。

AMPK是ACC2的上游调整激酶，不但可以下调ACC2表达，还可以磷酸化219位丝氨酸(Ser219)，降低ACC2活性，阻止肉碱脂酰转移酶(CPT-1)的抑制剂产生，加速长链脂肪酸酸转移至线粒体内膜，增加脂肪酸的氧化［9］。AMPK活性剂二甲双胍活化AMPK，从而减少ACC2 mRNA表达，使ACC2 mRNA表达恢复至接近正常水平。辛伐他丁也能够降低ACC2 mRNA的表达，推测脂肪在HepG2细胞中的堆积减少至少部分通过介导减少ACC2 mRNA表达有关。

二甲双胍和辛伐他丁能够改善软脂酸所致HepG2细胞糖原累积减少，主要通过降低PEPCK mRNA表达，抑制糖异生，同时上调GLUT2 mRNA表达，增加HepG2细胞表面葡萄糖转运，为糖原累积提供原料。二甲双胍和辛伐他丁都能够降低软脂酸所致HepG2细胞TC和TG含量增加。二甲双胍主要通过活化 AMPK，上调 HL mRNA表达，减少ACC2 mRNA表达，促进脂肪分解来减少脂肪堆积。

［1］Kim S P，Ellmerer M，Van Citters G W，et al.Primacy of hepatic insulin resistance in the development of the metabolic syndrome induced by and isocaloric moderate-fat diet in the dog［J］.Diabetes，2003，52(10):2453-60.

［2］Nakamarua K，Matsumotoa K，Taguchi T，et al.AICAR，an activator of AMP-activated protein kinase，down-regulates the insulin receptor expression in HepG2 cells［J］.Biochem Biophys Res Commu，2005，328(2):449-54.

［3］Brown A J，Jupe S，Briscoe C P.A family of fatty acid binding receptors［J］.DNA Cell Biol，2005，24(1):54-61.

［4］Gao D，Nong S，Huang X，et al.The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways［J］.J Biol Chem，2010，285(39):29965-73.

［5］陈 佳，谢作权，叶 赛，等.银杏叶提取物GBE50对HepG2细胞甘油三酯代谢的影响［J］.中国药理学通报，2010，26(7):961-4.

［5］Chen J，Xie Z Q，Ye S，et al.Effect of Ginkgo biloba extract(GBE50)on the metabolism of triglyceride in HepG2 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(7):961-4.

［6］Chun Y，Yin Z D.Glycogen assay for diagnosis of female genital Chlamydia atrachomatis infection［J］.J Clin Mictobiol，1998，36(4):1081-2.

［7］Zhou L，Li Y，Xia T，et al.Resistin over expression impaired glucose tolerance in hepatocytes［J］.Eur Cytokine Netw，2006，17(3):189-95.

［8］Lochhead P A，Salt I P，Walker K S，et al.5-Aminoimidazole-4-carboxamide riboside mimics the effects of insulin on the expression of the 2 key gluconeogenic gene PEPCK and glucose-6-phosphatase［J］.Diabetes，2000，49(6):896-903.

［9］Zhu Q Z，Hou Z C，Rui F Y，et al.Regulation of acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase 2 expression by saturated fatty acids［J］.Chin Med Sci J，2010，25(4):222-7.