采用FTIR法研究酸模叶蓼对锰胁迫生理响应的影响

薛生国，黄艳红，王钧，田守祥，雷杰，何哲祥

(中南大学 冶金科学与工程学院，湖南 长沙，410083)

矿业废弃地物理结构不良、养分缺乏、重金属毒性大等，一般植物难以生长[1]。植物稳定技术利用耐性植物降低重金属的生物有效性，是一种比较有应用前景的环境友好技术[2-3]。Baker[4]认为植物对重金属耐性的获得可通过2种途径：一是排斥性，即重金属被植物吸收后通过主动运输或老化器官脱落排出体外，或者重金属在植物体内的运输受到阻碍；另一途径是积累性，即重金属在植物体内以不具生物活性的解毒形式存在，如细胞壁的锰沉淀作用阻止过多的锰进入原生质，进入原生质的锰还可以通过向液泡中输送而减少原生质中的浓度，以有机酸，蛋白质类物质与锰反应形成沉淀和螯合物降低自由态的锰浓度。傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectrometry，FTIR)是一种基于化合物中官能团和极性键振动的结构分析技术，其作为一种分析生物高分子聚合物的方法，已广泛应用于大分子化合物结构分析以及蛋白质的二级结构解析，是获取分子结构信息的有力工具，而且只要各种化学成分的含量相对稳定，样品的处理方法按统一要求进行，其红外光谱是相对稳定的[5]。研究表明：酸模叶蓼(Polygonum lapathifolium)在 5.0 mmol·L-1和 10.0 mmol·L-1锰处理条件下，叶锰含量分别达18.71和27.66 g/kg(干重)生长正常，并未出现锰毒症状，是一种潜在的锰超积累植物，因此，探讨不同锰处理条件下其植物化学组成上的差异将有利于揭示其耐锰机制。目前，国内外对锰耐性植物不同组织器官化学组分进行FTIR的研究较少[6]，对酸模叶蓼的相关研究尚未见报道，为此，本文作者利用 FTIR对酸模叶蓼根、茎和叶的化学组分进行研究，以便为重金属污染环境修复提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验方法

酸模叶蓼种子播种于装有洗净细砂的花盆中育苗。待幼苗萌发2周后，依次在0.25 Hoagland营养液和0.50 Hoagland营养液预培养15 d，选取生长一致的酸模叶蓼幼苗，将根部用去离子水洗净，移至外壁不透光的塑料容器。设定6种锰浓度分别为0.005，0.2，0.5，2.0，5.0 和 10.0 mmol·L-1。锰以 MnCl2的形式加入，每个处理进行重复3次实验。每4 d换1次营养液，每天用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl调pH至5.5左右，保持连续通气。植物在35 d后收获，用去离子水洗净，分别取根、茎、叶3部分于105 ℃杀青30 min,然后于75 ℃烘箱中干燥48 h，用万能粉碎机粉碎，过75 μm筛。

1.2 傅里叶红外光谱分析

应用FRIR仪(美国Nicolet公司Nexus 670,光谱范围为4 000～500 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描累加次数32次)测定酸模叶蓼各组织器官光谱信息。

1.3 数据分析

实验数据采用Microsoft Excel 2003进行分析，并采用Origin(8.0)对红外光谱数据图谱进行处理。

2 结果与分析

2.1 根的FTIR分析

图 1所示为不同锰浓度酸模叶蓼根的红外光谱图，图2为其特征峰变化图。从图1可见：在3 420 cm-1附近的峰是分子间氢键 O—H自由羟基的伸缩振动峰，主要来自于纤维素、半纤维素、多糖等碳水化合物[7]；随着锰处理浓度的升高，吸收峰移向低频3 390 cm-1，同时峰形变窄。从图2可以看出：随着锰处理浓度的升高(0.005～2.0 mmol·L-1)，吸光度上下波动，但峰值总体变化不大，说明低外源锰处理对纤维素、半纤维素、多糖等碳水化合物的合成和运输影响不大；当锰浓度为2.0～5.0 mmol·L-1时，峰值随着外源锰处理浓度的升高而下降，根外表皮细胞壁的羟基吸附结合Mn2+形成稳定的化合物，使细胞表面的氢键减少；当锰浓度大于5.0 mmol·L-1时，峰值又呈上升态势，说明高外源处理浓度的锰可能破坏了根外表皮细胞壁的羟基吸附结合Mn2+的机制，导致根外表皮细胞壁的羟基无法结合Mn2+，引起峰值升高。

图1 不同锰浓度下酸模叶蓼根系的傅里叶红外光谱图Fig.1 Absorption FTIR spectra of roots of P. lapathifolium in different manganese concentrations

图2 不同锰浓度下酸模叶蓼根系的特征峰变化图Fig.2 Band height changes in roots of P. lapathifolium in different manganese concentrations

2 920 cm-1附近的吸收峰是饱和C—H 键的伸缩振动, 主要来自于细胞壁中蛋白质、纤维素和果胶等组织成分(图 1)；随着锰浓度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度未发生明显变化，表明低锰胁迫对细胞壁中的蛋白质、纤维素和果胶质等组织成分的分泌和运输影响不大；当锰浓度为0.5～5.0 mmol·L-1时，吸光度先上升后下降(图2)，说明随着锰浓度的升高，酸模叶蓼的根部细胞不断分泌有机酸，螯合锰的有机酸消耗速率和根部的有机酸分泌速率相互作用，导致羧酸频带先上升后下降；当锰浓度大于5.0 mmol·L-1时，羧酸螯合力变弱，锰毒害进一步加重，频带略微上升。

1 060 cm-1附近的吸收峰为碳水化合物(醇、醚基、酯基或酚)的C—O基团的伸缩振动[8](图1)。随着锰浓度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度变化不大，但在锰浓度为2.0 mmol·L-1时，出现显著吸收峰，峰值达到最大，当锰浓度大于2.0 mmol·L-1时，峰值下降；当锰浓度在0.5～2.0 mmol·L-1时，膜过氧化机制对峰值变化起主导作用，随着锰浓度的升高，膜过氧化程度加深，脂肪族酮类化合物过氧化产物在根部积累，引起峰值升高。而在锰浓度大于2.0 mmol·L-1后，高外源处理浓度的锰可能破坏了膜过氧化机制，造成脂肪族酮类化合物过氧化产物减少，引起峰值下降[9-11]。

2.2 茎的FTIR分析

图3 不同锰浓度下酸模叶蓼茎的傅里叶红外光谱图Fig.3 Absorption FTIR spectra of stems of P. lapathifolium in different manganese concentrations

图4 不同锰浓度下酸模叶蓼茎的特征峰变化图Fig.4 Band height changes in stems of P. lapathifolium in different manganese concentrations

图3 所示为不同锰浓度下酸模叶蓼茎的红外光谱图，图4所示为不同锰浓度下酸模叶蓼茎的特征峰变化图。从图4可见：随着生长介质锰浓度的升高，吸光度先下降后上升。这表明在外源锰的胁迫作用下(0.005～0.5 mmol·L-1)，茎细胞的细胞壁羟基吸附结合Mn2+，使细胞表面的氢键减少，引起峰值下降；而当生长介质锰浓度为0.5～10.0 mmol·L-1时，随着锰处理浓度的升高，该峰的吸光度上升。这说明高外源处理浓度的锰促进了纤维素、半纤维素、多糖等有机物的分泌和运输，酸模叶蓼则通过渗透作用来增强茎对外源锰的抗逆性。

2 920 cm-1附近的振动吸收带，主要来自于碳水化合物、维生素和各种膜及细胞壁的组织等成分，这与茎的运输功能有关。从图3可以看出：该处峰形未发生明显位移，肩峰变化不大。随着锰浓度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度变化不大，当锰浓度大于0.5 mmol·L-1时，吸光度轻微升高与下降(图4)。这表明锰浓度小于0.5 mmol·L-1时，低锰处理对酸模叶蓼茎的运输功能影响不大。在锰浓度大于 2.0 mmol·L-1时，促进酸模叶蓼产生碳水化合物等物质增强其锰耐性，但当锰浓度大于5.0 mmol·L-1时，高外源处理浓度的 Mn2+已经影响了细胞中碳水化合物等的合成和运输。

1650～1620 cm-1处为缔合态伯酰胺面内弯曲振动(δ N-H)的吸收带。从图4可见：随着锰浓度的升高(0.005～0.2 mmol·L-1)，吸光度下降，说明蛋白二级结构中，肽键间氢键的结合力变弱；当锰浓度大于 0.2 mmol·L-1时，吸光度上升，可能是由于不断增加的外源锰诱导富脯氨酸蛋白、病害相关蛋白和富甘氨酸蛋白等蛋白的合成，这些重金属胁迫诱导蛋白可能具有保护植物细胞免受重金属毒害的作用[9]，而锰浓度大于0.2 mmol·L-1时出现的吸收峰上升可能与酸模叶蓼叶中氨基酸、多肽和蛋白质类物质含量升高有关；当锰浓度大于2.0 mmol·L-1时，吸光度下降，说明蛋白二级结构中肽键间氢键的结合力受影响较大。

从图3看出：随着锰浓度的升高，其最大吸收带由对照的1 060 cm-1移到1 052 cm-1附近，但峰形变化不大，肩峰变化不明显；随着锰浓度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度变化不大。在锰浓度为2.0 mmol·L-1时，出现显著吸收峰，峰值达到最大；而当锰浓度大于2.0 mmol·L-1时，吸光度下降。说明锰浓度为0.5～2.0 mmol·L-1时，膜过氧化机制对峰值变化起主导作用，随着锰浓度的升高，膜过氧化程度加深，脂肪族酮类化合物过氧化产物在根部积累，引起峰值升高。当锰浓度大于5.0 mmol·L-1时，高浓度的Mn2+可能破坏了此机制，造成脂肪族酮类化合物过氧化产物减少，引起峰值下降。

2.3 叶的FTIR分析

图5为不同锰浓度下酸模叶蓼叶的傅里叶红外光谱图，图6为其特征峰变化图。3 420 cm-1附近的吸收峰反映叶片中碳水化合物(纤维素、半纤维素、多糖)、脂肪酸、蛋白质和核酸等对光谱的贡献(图 5)。由图 6可以看出：随着锰浓度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度无明显变化，说明低锰胁迫对酸模叶蓼叶片中碳水化合物等有机物的运输和合成没有明显影响，表现出酸模叶蓼对外源锰的耐性特征；当锰浓度大于0.5 mmol·L-1时，该峰的吸光度先下降后上升。说明随着锰浓度的持续升高，酸模叶蓼叶片的生理过程开始受到影响；当锰浓度大于0.5 mmol·L-1时，吸光度下降，这是因为叶片表皮细胞壁的羟基吸附结合锰，使细胞表面的氢键减少；当锰浓度大于 2.0 mmol·L-1时，吸光度上升。这说明随着锰浓度的升高促进了碳水化合物等有机物的分泌和运输，通过渗透作用来增强叶对锰的抗逆性。

2 920 cm-1处的吸收峰主要来自于维生素和各种膜及细胞壁的组织成分等，这与酸模叶蓼的运输功能有关(图 5)。该处肩峰变化不大，随着锰浓度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，吸光度变化不大。当锰浓度大于0.5 mmol·L-1时，吸光度先下降后升高。说明低浓度的Mn2+对酸模叶蓼中羧酸等物质运输影响不大，但在锰浓度大于0.5 mmol·L-1时，吸光度下降，是因为叶部中有机酸不断螯合Mn2+，降低Mn2+对叶的毒害。当锰浓度大于2.0 mmol·L-1时，吸光度的上升，则说明随着锰供应水平的不断升高，促进了碳水化合物等有机物的分泌和运输，通过渗透作用来增强叶对锰的抗逆性。

从图 6可见：随着锰浓度的升高(0.005～0.5 mmol·L-1)，1 650～1 620 cm-1处的吸收峰变化不大。说明蛋白二级结构中肽键间氢键的结合力受影响较小；当锰浓度大于2.0 mmol·L-1时，吸光度下降。说明随着锰浓度的升高，蛋白二级结构中，肽键间氢键的结合力变弱；当锰浓度大于2.0 mmol·L-1时，吸光度上升，可能是由于不断增加的外源锰诱导富脯氨酸蛋白、病害相关蛋白和富甘氨酸蛋白等一些蛋白的合成，Didierjean等[12]认为这些重金属胁迫诱导蛋白可能具有保护植物细胞免受重金属毒害的作用；而浓度大于2.0 mmol·L-1时出现的吸收峰上升可能与酸模叶蓼叶中氨基酸、多肽和蛋白质类物质含量升高有关。

图5 不同锰浓度下酸模叶蓼叶的傅里叶红外光谱图Fig.5 Absorption FTIR spectra of stems of P. lapathifolium in different manganese concentrations

图6 不同锰浓度下酸模叶蓼茎的特征峰变化图Fig.6 Band height changes in leaves of P. lapathifolium in different manganese concentrations

随 着锰 浓 度的 升高(0.005～0.500 mmol·L-1)，1 060cm-1附近吸收峰值(图5)无明显变化。说明低浓度的Mn2+对该类物质的运输影响不大。当锰浓度大于0.5 mmol·L-1时，吸光度出现略微下降。说明当锰浓度大于0.5 mmol·L-1时，外源Mn2+已影响了酸模叶蓼中碳水化合物的运输。当锰浓度大于2.0 mmol·L-1时，吸光度上升，可能是膜过氧化程度加深，脂肪族酮类化合物过氧化产物在叶部积累，引起峰值升高。

3 结论

(1) 糖类和氨基酸等有机化合物在低锰浓度处理下往往作为渗透性调节物质出现，含量升高，其耐锰性增强，但随着锰浓度的升高，其合成和运输受限，含量逐渐下降。

(2) 根和叶分别在2 920 cm-1和1 630 cm-1处表现为酸模叶蓼分泌有机酸不断螯合锰，造成羧酸 O—H减少；随着锰浓度的升高，其羧酸螯合力变弱；叶在1 630 cm-1处的显著吸收峰可能与酸模叶蓼叶中氨基酸、多肽和蛋白质类物质含量升高有关。

(3) 酸模叶蓼根、茎、叶在1 060 cm-1处在最高锰浓度下吸光度特征峰值的变化，主要表现是膜脂过氧化，这可能与酸模叶蓼的锰耐性有关。

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