加味附子理中免煎颗粒对急性马兜铃酸肾病大鼠抗氧化作用的研究*

史 伟,黄仁发,蓝 芳,陈延强

(1.广西中医学院第一附属医院肾内科,广西 南宁 530023;2.广西中医学院附属瑞康医院,广西 南宁 530011)

加味附子理中免煎颗粒对急性马兜铃酸肾病大鼠抗氧化作用的研究*

史 伟1,黄仁发2,蓝 芳1,陈延强1

(1.广西中医学院第一附属医院肾内科,广西 南宁 530023;2.广西中医学院附属瑞康医院,广西 南宁 530011)

目的：观察加味附子理中免煎颗粒对急性马兜铃酸肾病大鼠的抗氧化作用。方法：在应用马兜铃酸A纯品灌胃致急性马兜铃酸肾病大鼠模型上,观察加味附子理中免煎颗粒对急性马兜铃酸肾病大鼠肾组织SOD、MDA水平的变化及肾脏病理改变。结果：中药组可增加急性马兜铃酸肾病大鼠肾组织SOD、降低MDA的表达,中药和强的松联合处理后较其他组更能明显增加急性马兜铃酸肾病大鼠肾组织SOD、降低MDA的表达(P＜0.01),减轻肾脏病理损害。结论：加味附子理中免煎颗粒联合强的松治疗可以改善大鼠肾脏的氧化应激,减轻肾脏病理损害。

加味附子理中汤;马兜铃酸肾病;超氧化物歧化酶;丙二醛

急性马兜铃酸肾病为一次或短期大量服用马兜铃酸(Aristolochic acid,AA)所致,病理表现为肾小管坏死或肾小管上皮细胞凋亡。目前认为,细胞凋亡是急性肾衰竭(Acute renal failure,ARF)时肾小管上皮细胞死亡的重要形式[1],细胞凋亡在AA引起的肾毒性损害中扮演了关键的角色[2],而氧化活性氧族可以使肾小管上皮细胞受损,可以导致肾小管上皮细胞凋亡[3]。笔者前期临床研究表明,加味附子理中免煎颗粒能有效改善马兜铃酸肾病(Aristolochic acid nephropathy,AAN)患者肾功能[4],本实验通过观察加味附子理中免煎颗粒对急性马兜铃酸肾病大鼠肾组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平的影响及肾脏病理改变,探讨其对肾脏的保护机制,为临床应用加味附子理中免煎颗粒治疗急性马兜铃酸肾病提供依据。

1 材料

1.1 动物 清洁级 SD大鼠 90只,雌雄各半,体重(250±20)g,购自上海斯莱克景达实验动物有限公司长沙分公司(动物合格证号：SCXK(湘)2009-0004)。

1.2 药品与试剂 加味附子理中免煎颗粒(制附子8 g,干姜6 g,人参12 g,黄芪15 g,当归10 g,白术15 g,茯苓12 g,法半夏6 g,炙甘草6 g),由江苏江阴天江药业有限公司生产;醋酸泼尼松片,广东阿特维斯(佛山)制药有限公司生产,产品批号：0810535;马兜铃酸A化学对照品,中国药品生物制品检定所提供;SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);兔抗鼠多克隆SOD抗体(武汉博士德生物技术有限公司);兔抗鼠多克隆MDA抗体(武汉博士德生物技术有限公司)。

2 方法

2.1 实验分组及造模、给药方法 将90只大鼠按完全随机的方法分为5组,模型组、中药组、强的松组、中药+强的松组(各组均为20只)、正常组10只,予马兜铃酸A纯品100 mg/kg◦d,连续灌胃3 d建立模型,正常组：给予生理盐水灌胃,自由饮食3周。模型组：给予蒸馏水灌胃,自由饮食3周。中药组：给予加味附子理中免煎颗粒(10 mL◦kg-1◦d-1)灌胃,自由饮食3周。强的松组：给予强的松片治疗(0.5 mg◦kg-1◦d-1)灌胃,自由饮食3周。中药+强的松组：给予加味附子理中免煎颗粒(10 mL◦kg-1◦d-1)及强的松片(0.5 mg◦kg-1◦d-1)灌胃,自由饮食3周。

2.2 处理及指标观察 实验第3周结束时将大鼠行过量麻醉处死,剖腹,分离肾脏,将双肾剥离干净,置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中,固定 24 h后,常规石蜡包埋、切片,行 HE染色。按免疫组化试剂盒程序进行检测肾组织SOD和MDA的表达。阳性表达部位呈棕黄色深染;CMLAS医学图像分析系统进行半定量分析,10×20倍视野下通过测量SOD、MDA阳性表达的平均光密度(Mean optical density,M OD)反映其阳性程度。

2.3 统计学方法 采用SPSS11.0软件包,数据以(±s)表示,组内均数用配对t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析;组间均数两两比较采用q检验。

3 结果

3.1 光镜下HE染色结果 光学显微镜所见,正常组肾脏结构清楚,肾小球及肾小管无病理改变;模型组肾小球未见明显病变,但肾小管可见坏死、钙化、刷状缘丢失、小管扩张、管腔管型等病理改变,间质可见大量的炎症细胞浸润,并可见少量的肌成纤维细胞;中药组肾小球也未见明显病理改变,肾小管间质可见坏死、刷状缘丢失、小管扩张、管腔管型、小管间质炎症细胞浸润等病理改变,与模型组相比较,病理改变无明显改善;强的松组肾小球也未见明显病理改变,肾小管也可见上述等病理改变,但比模型组稍改善;中药+强的松组大鼠小管结构较模型组明显完整清晰,管腔内容物较模型组明显减少,炎症细胞浸润也明显减轻,病理改变明显减轻。

3.2 各组肾组织MDA、SOD含量比较

表1 免疫组化半定量分析后SO D、MDA平均光密度的含量表达(MOD×10-2)

由上表可知,模型组与正常组比较,SOD阳性细胞表达明显减少,MDA明显增加(P＜0.01);中药组较模型组SOD阳性细胞数增加,MDA减少(P＜0.01);强的松组大鼠肾小管及间质 SOD较中药组有所增多,而 MDA减少(P＜0.01);中药+强的松组大鼠SOD最多,而 MDA较强的松组明显减少(P＜0.01)。以上结果提示单纯中药处理可以增加肾小管和间质SOD的表达,降低MDA表达,较强的松组效果欠佳,但中药和强的松联合处理后却能明显增加SOD的表达,明显降低MDA表达,可以更好发挥保护肾脏作用。

3 讨论

MDA是脂质过氧化产物之一,含量增高时,引起明显的组织或细胞损伤,而SOD是组织自身产生的抗氧化酶,对组织或细胞具有保护作用,MDA、SOD活性高低可间接反映机体清除自由基的能力。由于体内外各种因素刺激,常引起体内超氧化物歧化酶(SOD)活性降低、丙二醛(MDA)增高,氧自由基清除减少,导致氧自由基增多。体内代谢或外源性因素产生的自由基均被证实可诱导细胞凋亡[5]。已有研究显示,A RF时血清和肾组织中SOD活性降低、MDA增高,表明氧自由基参入了ARF的发病过程[6]。

笔者的实验结果显示,加味附子理中免煎颗粒可提高肾组织SOD活性,降低MDA水平,减轻肾脏病理损害,联合使用强的松后提高肾组织SOD活性,降低MDA水平作用更明显。加味附子理中免煎颗粒组方主要由制附子、干姜、人参、黄芪、当归、白术、茯苓、法半夏、炙甘草共同组成,在既往的研究及本次实验中,急性马兜铃酸肾病大鼠均出现了畏寒聚堆、活动减少、精神萎靡、反应迟钝、大便溏烂等阳虚的症状,而组方中附子大辛大热,功善回阳救逆、补火助阳,主治一切阳虚阴盛之证,用来治疗马兜铃属药物所致的中毒病证,配合辛热的干姜增强温中祛寒扶助脾阳作用,为君药;人参,黄芪甘温益气健脾,使气旺而阳亦复,是臣药;白术、炙甘草健脾益气和中,共为佐使药;加茯苓、法半夏可调理中焦、健脾和胃,使中焦脾胃的升清降浊功能得到恢复,诸药配伍,具有温阳祛寒、益气健脾作用,可以使马兜铃酸肾病者受损之脾阳得到恢复,从而减轻其一系列临床症状。同时,现代药理及实验研究亦表明：附子可提高 SOD活性、清除氧自由基、抗脂质过氧化[7],人参中主要成分人参总皂苷具有降低脂质过氧化反应,清除自由基,保护血管内皮细胞等作用[8]。黄芪具有增强SOD活性、减轻脂质过氧化,改善肾组织结构,保护肾脏功能的作用[9]。当归中当归多糖可明显升高血瘀证大鼠心、脑、肾、胰四脏器SOD活性,降低MDA含量,具有抗氧化效应;对超氧阴离子自由基和羟自由基均有良好的清除能力[10～11];白术亦能显著提高大鼠肾皮质中SOD的含量[12]。实验提示加味附子理中免煎颗粒对肾脏的保护作用可能主要与其保护抗氧化酶的活性、清除氧自由基、抑制体内的脂质过氧化反应、提高机体的抗氧化能力有关。

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Study on the Antioxidant Effect of Flavored Fried-free Aconite Particles on Acute Aristolochic Acid Nephropathy Rats

SHI Wei,H UANG Ren-fa,LAN Fang,et al
(Department of Nephrology,First Affiliated Hospital,Guangxi Traditional Chinese Medical College,Nanning,Guangxi,530023)

Objective：To observe the antioxidant effect of flavored fried-free aconite particles on acute aristolochic acid nephropathy rats.Methods：Pure aristolochic acid A was used to induce acute aristolochic acid nephropathy rat models to observe the changes of SOD、MDA levels and the renal pathological changes of the acute aristolochic acid-induced nephropathy rats.Results：The Chinese herbal medicine group could increase SOD of the renal tissue and reduce the expression of MDA of the acute aristolochic acid-induced nephropathy rats.The Chinese herbal medicine group combined with prednisone significantly increased more SOD of the renal tissue and lower more MDA expression(P ＜0.01)than other groups and reduced the renal pathological damage.Conclusion：The flavored fried-free aconite particles combined with prednisone can improve the oxidative stress in rat kidneys and reduce the renal pathological damage.

flavored fried-free aconite particles;aristolochic acid nephropathy;superoxide dismutase;malondialdehyde

R285

A

1007-2349(2011)07-0061-03

广西科学基金资助项目(编号：桂科自0832173)

史伟(1960～),女,广西融安人,主任医师,硕士研究生导师,主要从事中西医结合防治肾病、风湿病的研究工作。

2011-01-24)