北豆根中蝙蝠葛碱的稳定性研究

刘全宇， 刘文义

(1.黑龙江省兽药饲料监察所，黑龙江 哈尔滨 150069;2.佳木斯大学附属第一医院肿瘤科，黑龙江 佳木斯 154000)

北豆根为防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauriccmD的干燥根茎，始载于《中国药植志》［1］，苦，寒，归肺、胃、大肠经。清热解毒，祛风止痛。主要成分为生物碱，约1%以上［2］。其总碱具有祛痰镇咳作用［3］，制剂临床上常用于治疗咽喉炎。现代药理学研究发现其中的酚性总碱和蝙蝠葛碱(Dauricine)对脑梗塞和心肌缺血有良好的治疗作用［4］，梁文杰等［5］证实北豆根的醇提物，主要成分为蝙蝠葛碱，对人红白血病细胞株、人胃癌细胞株及TE13肿瘤细胞的增殖反应均有明显的抑制作用，且对肿瘤组织原代培养细胞增殖反应具抑制作用。在开发新药研究上，有很好的利用价值。

蝙蝠葛碱为双苄基异喹啉类结构，白色粉末，研究中发现，其化学成分稳定性较差，光照或室温长时间放置后均变黄，受外界环境的物理和化学因素影响而发生含量下降成分降解的现象。总生物碱中双苄基异喹啉类生物碱量最高［6］，作为主要的活性成分，其稳定性直接影响了制剂的性质。王楠等［7］对北豆根酚性总碱粉针剂中蝙蝠葛碱量进行了室温下3个月的初步稳定性考察。通过HPLC法测定，3个月内总碱中蝙蝠葛碱的质量分数在70%左右。在剧烈还原条件下，双苄基异喹啉类生物碱杂环可发生裂环反应生成季铵盐［8］。陈勇等［9］在对北豆根生物碱的质谱研究中，发现双苄基异喹啉类生物碱亦可氧化开环并失去N甲基而生成季铵盐。在双苄基异喹啉生物碱氧原子的研究中发现，某些生物碱中含有酚羟基，在酸碱条件下，如遇到酸酐、酰氯及羧酸等酰化剂作用，可得O-酰化物［10］。

稳定性研究目的是考察原料药或制剂的性质在温度、湿度、光线等条件的影响下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存、运输条件和有效期的确定提供科学依据，以保障临床用药安全有效［11］。本试验对蝙蝠葛碱单体的温度，光照等因素进行探讨。

1 方法学考察

1.1 仪器、试剂和样品

LC-2010型HPLC(日本岛津);真空恒温干燥箱;紫外灯;乙腈、甲醇为色谱纯;三乙胺、磷酸为分析纯;蝙蝠葛碱对照品(纯度99.15%)，蝙蝠葛碱供试品均为实验室自制。

1.2 色谱条件 色谱柱:ODS-C18柱(Hypersil ODS2，4.6 mm×150 mm，5 μm);流动相缓冲液(将 0.68 mL 磷酸和0.71 mL的三乙胺加纯净水至500 mL，过0.45 μm水系微孔滤膜)-乙腈(76∶24);检测波长281 nm;柱温40℃;体积流量1.0 mL/min;进样量 10 μL［4］。

1.3 对照品溶液的制备 精密称取蝙蝠葛碱对照品0.012 6 g置于50 mL量瓶中，加缓冲液超声20 min溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm水系微孔滤膜，配成质量浓度为0.252 0 mg/mL的对照品溶液。

1.4 线性关系 取对照品溶液分别进样2、4、6、8、10 μL，按上述色谱条件测定峰面积，以进样量(质量)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线。得回归方程为Y=382 796X－21 727，r=0.999 9。表明蝙蝠葛碱在 0.504 0 ～2.520 0 mg质量范围内呈线性关系。

1.5 精密度试验 取上述对照品溶液，按上述色谱条件重复进样5次，其峰面积的积分值。RSD为0.18%，表明试验设备精密度良好。

1.6 重复性试验 取同一批样品的5个试样按1.3项下方法制备供试品溶液，平行测定，记录峰面积值，RSD为1.05%，表明样品测定方法重现性良好。

1.7 稳定性试验 按1.3项下方法制备供试品溶液，取同一供试品溶液，每隔2 h测定1次，测定5次。记录其峰面积的积分值，RSD为0.36%，表明10 h内该测定方法稳定可靠。

1.8 回收率试验 取已知浓度的供试品溶液，精密称定5份，分别加入蝙蝠葛碱对照品10 mL(相当于2.520 0㎎)量瓶中，加缓冲液超声20 min溶解并稀释至刻度，摇匀，按样品测定方法测定，计算回收率，5份样品平均回收率为99.99%，RSD为0.37%(n=5)，回收率较高方法可靠。

2 温度对蝙蝠葛碱的影响

采用经典法(恒温加速试验法)，将蝙蝠葛碱适量分别放置于40、60、80、100℃的恒温箱中进行加速试验，每隔5 d取样进行定量分析。称取每批样品约5 mg置于50 mL量瓶中，加缓冲液超声20 min溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm水系微孔滤膜。使用1.2项下HPLC法测定。见表1～2。

表1 不同时间和不同温度条件下蝙蝠葛碱的测定结果

将上述数据以lgC对反应时间t作回归方程，符合方程:lgC=－K/2.303t+lgC0。可确定蝙蝠葛碱随时间，温度变化符合一级降解反应。求得各温度点的K值及lgK。

表2 不同温度条件下蝙蝠葛碱稳定性参数

蝙蝠葛碱的降解速率常数随温度增大而逐渐增大，根据Arrhenius公式:得 lgK= －2 622.6/T+4.973 1，r=0.957 5。外推得K25℃=1.502 6 × 10－4，K0.925℃=0.105 4/0.000 150 264≈701.4(d)=1.92(年)。表明在25℃室温条件下蝙蝠葛碱下降1 0%需要大约1.92年。

3 光照对蝙蝠葛碱单体的影响

将蝙蝠葛碱适量分别放置于避光阴凉处、4 500lx光强度的日光灯光照箱及365 nm紫外灯照射下，每隔5 d取样进行定量分析。称取每批样品约5 mg置于50 mL量瓶中，加缓冲液超声20 min溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm水系微孔滤膜。使用1.2项下HPLC法测定。见表3，图1。

表3 光照因素下蝙蝠葛碱的测定结果

避光阴凉条件下:lgC= －6.397 5×10－5t+2，‘r=0.999 4，K=1.473 3 × 10－4，K0.9=715.4。日光光照箱下:lgC= －1.987 6 ×10－4t+2，r=0.995 6，K=4.577 4 × 10－4，K0.9=230.3。365 nm 紫外光条件下:lgC= －3.344 1 ×10－4t+2，r=0.999 1，K=7.701 5 ×10－4，K0.9=136.9。

蝙蝠葛碱变化速率K紫外光＞K日光＞K避光。光因素影响明显。

图1 蝙蝠葛碱稳定性色谱图

4 讨论

药物的稳定性包括物理稳定性、生物稳定性和化学稳定性。蝙蝠葛碱由两个苄基异喹啉类结构通过醚键连接，含有酚羟基与N原子，为酚性生物碱。单体长时间放置或经历高温光照等因素后，颜色由白色转向淡黄色，含量下降。对其化学稳定性进行探讨，蝙蝠葛碱单体在室温条件下t0.9大约1.92年，比较稳定。随着温度增加，其变化速率加快，以lgC对t做图，|r|均大于0.99，线性良好，表明蝙蝠葛碱降解规律均符合一级动力学方程。

由于吸收给定波长的光子往往是分子中某个基团的性质，所以光化学提供了使分子中某特定位置发生反应的最佳手段［12］。蝙蝠葛碱结构中有苯环的不饱和共轭体系与酚羟基，既有发色团又有助色团。本试验在HPLC上发现，随着光照时间的延长，蝙蝠葛碱含量降低，两侧出现小的杂质峰，推测其在光照条件下分解成其他成分。本试验以考察蝙蝠葛碱单体的含量变化出发，根据2010年《中国药典》［13］规定，光强化试验应以装有日光灯的光照箱，光强度以4500lx±500lx的条件下第5、10天取样检测。本试验选择避光、450 0lx日光光照箱及365 nm紫外灯条件对蝙蝠葛碱，每隔5 d取样测定至30 d，结合试验数据得出蝙蝠葛碱在避光、日光以及紫外灯情况下降解均符合合一级动力学方程。蝙蝠葛碱单体光因素下不稳定，应保存在避光阴凉处。

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