HPLC测定青藏高原不同地区藏药手掌参中天麻素

薛 楠， 薛 敬， 林鹏程

(青海民族大学化生院，青海西宁 810007)

手掌参GymnadeniaconopseaR.Br.又名佛手参、手参、掌参，是兰科Orchidaceae手参属一种多年生草本植物，因其地下根茎形似手掌而得名，主要生长在青藏高原海拔2 700～4 000 m范围内无污染的灌木丛中，为常用名贵藏药［1-2］。手掌参味甘，性温，具有增力生精、温肾暖肾、大补元气、安神增智等功效。尤其对阳痿、肾寒有益，具有很高的药用价值，因而有“不老草”之称［3-6］。天麻素是手掌参主要有效成分之一［7］，现代药理研究表明，天麻素具有镇痛、抗惊厥、抗衰老、增加心脑血流量、改善学习记忆力等作用［8］。为了有效控制药材的质量［9］，本实验建立了青藏高原不同地区手掌参中天麻素含量的高效液相色谱测定方法。该方法快速、简便、准确、重复性好，不仅适用于手掌参原药材的质量控制，还可供手掌参制剂借鉴。

1 仪器与材料

Agilent 1100高效液相色谱仪(配置手动进样器，在线脱气机，高压二元梯度泵，恒温柱温箱，DAD检测器，Agilent 1100色谱工作站);HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司);FZ102微型植物试样粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。实验用试剂甲醇为高效液相色谱专用试剂(山东禹王实业有限公司禹城化工厂);水为自制三重蒸馏水;磷酸为AR级(北京红星化工厂);天麻素对照品由本课题组分离鉴定，纯度大于99% 。手掌参样品系2009年9月采于青藏高原不同地区，由青海民族大学药学系林鹏程教授鉴定，样品阴干后粉碎过80目筛，冷藏保存。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱 Hypersil ODS-2(4.6 mm ×250 mm，5 μm)柱;流动相甲醇-水(含0.04%的磷酸)=8∶92;体积流量1 mL/min;检测波长222 nm;柱温30℃，进样量20 μL。该色谱条件下天麻素被洗脱且达到基线分离，保留时间为9.21 min(见图1)。

2.2 溶液配制

精密称取天麻素对照品3.50 mg置10 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，配制成对照品溶液。精密称取手掌参样品粉末1.0 g，加入50%的甲醇15 mL，热回流提取2 h，抽滤，滤渣重复处理1次，合并滤液，浓缩后定容至25 mL量瓶中，过0.45 μm 滤膜，即得样品溶液。

2.3 线性关系

精密量取天麻素对照品溶液适量，用甲醇准确稀释成下列浓度:0.070、0.140、0.210、0.280、0.350 和0.420 g/L 的系列对照品稀释液，取各稀释液进样20 μL，记录峰面积。以峰面积(A)为纵坐标，进样量C(μg)为横坐标，得天麻素的回归方程为:A=512.91C+0.35，r=0.999 9。线性范围为:1.400 ～8.400 μg。当信噪比 S/N=3 时，天麻素的检测限为0.32 ng。

图1 天麻素对照品(A)和手掌参样品(B)HPLC图1.天麻素

2.4 精密度实验

精密吸取浓度为0.210 g/L的天麻素对照品稀释液20 μL，在2.1项色谱条件下重复进样5次，记录峰面积，计算RSD为0.41%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验

精密称取手掌参样品1.0 g共5份，分别按2.2项下方法制备成样品溶液，然后在2.1项色谱条件下测定天麻素，计算得RSD为1.4%(n=5)，表明方法重复性良好。

2.6 稳定性实验

取新配制的样品溶液，分别在 0、2、4、6、8 h时进样，测定天麻素的峰面积，计算得RSD为1.3%(n=5)，表明样品溶液在8 h内稳定。

2.7 回收率实验

精密称取已测定的手掌参(3#样品)1.0 g共9份，分为3组，每组3份，分别添加低、中、高3种浓度的天麻素对照品液适量，按2.2项下方法操作，测得天麻素平均回收率(n=9)为99.14%，RSD 为0.69%。结果见表1。

2.8 样品测定

取2.2项下制备的青藏高原不同地区手掌参样品溶液按2.1项色谱条件进行分析，经DAD检测器验证天麻素的峰纯度后，按外标法以峰面积计算，得青藏高原不同地区手掌参样品中天麻素的量(n=3)。结果见表2。

表1 天麻素回收率测定结果

表2 青藏高原不同地区手掌参中天麻素的测定

3 讨论

3.1 样品提取方法的确定［10］

考察冷浸、超声和热回流对手掌参中天麻素的量的影响，结果热回流提取率最高。又分别以水、甲醇、乙醇为溶剂，考察不同溶剂对分析结果的影响，发现甲醇对天麻素提取率最高。利用正交试验进一步考察不同浓度甲醇、不同溶剂量、不同提取时间和提取次数对天麻素的量的影响，方差分析结果表明，天麻素提取率的影响因素依次为:甲醇浓度＞提取时间＞溶剂量＞提取次数。考虑实际工作的方便、快捷，经进一步试验，确定最佳提取方法为甲醇浓度50%，溶剂量15 mL，提取时间2 h，提取次数2次。

3.2 流动相的选择

天麻素色谱峰易拖尾，经试验，当在水中加入0.01% ～0.10%磷酸时可改善天麻素峰形。最终选择甲醇和含0.04%的磷酸水溶液(8∶92)为流动相。

3.3 检测波长的确定［11］

利用DAD检测器在200～400 nm扫描对照品溶液的吸收光谱，结果在222 nm处有最大吸收，因此选择该波长为检测波长。

3.4 测定结果分析

青藏高原不同地区藏药手掌参中天麻素测定的结果显示，手掌参中天麻素质量分数在2.268～9.113 mg/g之间，含量有较大差异，其中以同德县手掌参中天麻素中的量为最高。

［1］杨永昌.藏药志［M］.西宁:青海人民出版社，1995:246.

［2］中国科学院西北高原生物研究所.青海植物志:第4卷［M］.西宁:青海人民出版社，1999:295-318.

［3］青海省药品检验所，青海省藏医药研究所.中国藏药:一卷［M］.上海:上海科学技术出版社，1996:341-344.

［4］李 敏，王春兰，郭顺星，等.手参属植物化学成分及药理活性研究进展［J］.中草药，2006，37(8):1264-1268.

［5］覃筱燕，云妙英，唐 丽，等.藏药旺拉的化学成分及药理活性的研究进展［J］.中央民族大学学报:自然科学版，2007，16(3):229-232.

［6］Matsuda H，Morikawa T，Xie H H，et al.Antiallergic phenathrenes and stilbene from the tubers of Gymnaenia conopsea［J］.Planta Med，2004，70(9):847-855.

［7］訾佳辰.手参的化学成分研究［D］.中国协和医科大学，2008.

［8］何 晶.天麻素的药理作用及临床应用［J］.天津药学，2006，18(5):62-63.

［9］杨蓓蓓，李 帅，张瑞萍，等.HPLC测定藏药手掌参旺拉中4种有效成分的含量［J］.中国中药杂志，2009，34(14):1819-1822.

［10］林鹏程，王永菊，祝存恩，等.青海不同地区藏药麻花艽中环烯醚萜苷类成分的含量测定与品质评价［J］.中国药学杂志，2006，41(10):783-785.

［11］伍振峰，何 伟，马建春.天麻中天麻素含量测定方法改进的研究［J］.中成药，2009，31(6):966-967.