大孔树脂对金蓝胶囊提取液的分离纯化工艺研究

2011-05-26盛华刚朱立俏林桂涛

中成药 2011年5期

盛华刚，朱立俏，林桂涛

(山东中医药大学，山东济南 250355)

金蓝胶囊由金荞麦、沙棘、绞股蓝和肿节风组成，具有清热解毒护阴，凉血活血止咳的功效，对肺癌具有较好的疗效，现将其研制成新药。在金蓝胶囊的提取工艺研究中［1］，金荞麦单独提取，沙棘、绞股蓝、肿节风三味药材合并提取。对金荞麦提取液采用大孔树脂分离纯化已进行了研究，取得了较好的效果［2］。大孔树脂对单味药的纯化研究较多，对于复方制剂的研究较少，其纯化应采用多成分指标进行研究［3-7］。本试验以沙棘、绞股蓝、肿节风三味药材提取液中沙棘和肿节风中所含的总黄酮、绞股蓝中的绞股蓝皂苷、肿节风中的异秦皮啶为指标，进行大孔树脂纯化研究，从而为大孔树脂用于中药复方制剂的纯化提供参考。

1 仪器、材料与药材

LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津)，UV-754分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。芦丁对照品(100080-200306)，人参皂苷Rb1对照品(110704-200318)，异秦皮啶对照品(0837-200203)均购自中国药品生物制品检定所;所用试剂中乙腈为色谱纯，其它为分析纯;D-101、DA-201、DM-301大孔树脂(天津海光化工有限公司)。沙棘、绞股蓝、肿节风药材购于济南建联中药店，经山东中医药大学周凤琴教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 提取液和上样药液的制备

沙棘、绞股蓝、肿节风三味药材加70%乙醇，加热回流提取2次，第1次加12倍量，第2次加8倍量，每次提取3 h，滤液回收乙醇，浓缩，加水定容至浓度为0.3 g生药/mL，作为提取液。提取液以2 500 r/min离心10 min，收集离心液，沉淀加少量热水混悬，再次离心，合并两次离心液，调整浓度为0.3 g生药/mL，作为上样药液。

2.2 大孔树脂的预处理

试验所采用的树脂皆是医药级树脂，不需用酸碱进行前处理，只需用95%乙醇浸泡至充分溶胀，再用蒸馏水冲洗至无醇味即可使用。

2.3 提取液和上样药液的成分测定［1］

2.3.1 总黄酮测定标准曲线的制备:精密称取芦丁对照品10.18 mg，置25 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度。精密吸取 0.25，0.75，1.5，3.0，6.0 mL 分别置 25 mL 量瓶中，加无水乙醇至6.0 mL，摇匀，分别加入1.0 mL 5% 亚硝酸钠溶液，混匀，放置6 min，加入1.0 mL 10%硝酸铝溶液，混匀，放置6 min，加入10.0 mL 10%NaOH 溶液，混匀，放置 15 min，加水至刻度，于500 nm处测定吸收度。回归方程为Y=－0.003 51+0.011 15X(r=0.999 9)，芦丁在 0.102 ～2.436 mg范围内有良好的线性关系。

供试品溶液中总黄酮的测定:精密吸取供试品溶液10 mL，通过聚酰胺柱(50 ～80 目，2.5 g，ф1.5 cm)，先用 100 mL水洗脱，再用100 mL无水乙醇洗脱，收集无水乙醇洗脱液，蒸干，残渣用无水乙醇定容至10 mL。精密吸取0.5 mL，按标准曲线项下操作测定含量。结果见表1。

2.3.2 绞股蓝皂苷测定标准曲线的制备:精密称取人参皂苷Rb1对照品2.03 mg置1 mL量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取10，20，40，60，80，100 μl分别置 5 mL 量瓶中，热风挥去溶剂，加0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，60℃水浴加热15 min，取出，迅速用冷水冷却，冰醋酸定容至刻度，放置30 min，于550 nm处测定吸收度。回归方程为Y=0.008 18+0.021 18X(r=0.9993)，人参皂苷 Rb1在 4.06～40.6 μg/mL范围内有良好的线性关系。

供试品溶液中绞股蓝皂苷的测定:精密吸取供试品溶液10 mL，用乙醚提取至乙醚层无色，水层用同体积水饱和正丁醇提取6次，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加10 mL水溶解，通过D-101大孔树脂柱(1.5 cm×13 cm)，先用100 mL水洗脱，继用100 mL 70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇定容至5 mL。精密吸取50 μL，按标准曲线项下操作测定含量。结果见表1。

2.3.3 异秦皮啶含量测定色谱条件:Kromasil C18色谱柱(5 μm、4.6 mm ×200 mm);流动相为乙腈－0.1%磷酸溶液(20∶80);检测波长为344 nm;体积流量为1.0 mL/min;温度为室温。

标准曲线的制备:精密称取异秦皮啶对照品1.01 mg置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，各吸取20 μl进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程为Y=2 156+1 995 550X(r=0.999 9)，异秦皮啶在0.0404 ～0.404 μg范围内有良好的线性关系。

供试品溶液中异秦皮啶的测定:精密吸取供试品溶液5 mL，用三氯甲烷提取5次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用甲醇定容至10 mL，摇匀，注入液相色谱仪，测定含量。结果见表1。

表1 提取液和上样药液有效成分分析

2.4 大孔树脂型号的确定

取D-101、DA-201、DM-301 3种型号的大孔树脂各18 mL装柱(ф1.5 cm ×10.5 cm)，量取 100 mL 上样药液通过树脂柱，收集流出液;先用100 mL水洗脱，收集水洗脱液;再用100 mL 70%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，上柱体积流量和洗脱体积流量控制为0.5 mL/min。按2.3项下的方法测定流出液、水洗脱液和乙醇洗脱液中有效成分的量，计算3种型号树脂的比吸附量和洗脱率。结果见表2。

表2 3种型号树脂比吸附量和洗脱率比较

由表2可以看出，D-101大孔树脂对总黄酮、绞股蓝皂苷、异秦皮啶均有较好的吸附和洗脱效果，因此采用D-101大孔树脂进行纯化。

2.5 上样工艺的研究

采用大孔树脂纯化过程中，药液浓度、体积流量、pH值等因素会对成分的吸附产生影响［8］，无机盐浓度会对总皂苷的吸附存在影响［9］，甚至是影响总皂苷大孔树脂比吸附量的重要因素［10］，所以将无机盐浓度也列为考察因素之一。因素水平见表3。

2.5.1 试验方法量取浓度为0.15 g生药/mL的药液160 mL，0.30 g生药/mL 的药液 80 mL，0.60 g生药/mL 的药液40 mL，通过 D-101 大孔树脂柱(ф1.5 cm ×10.5 cm)，各因素水平按正交表中的设计操作，收集流出液;用100 mL水洗脱，体积流量为2 BV/h，收集水洗脱液。测定流出液、水洗脱液中有效成分的含量，以有效成分的比吸附量为指标，采用综合评分法优选最佳上样工艺。结果见表4。方差分析见表5。

表3 上样工艺考察因素及水平

表4 上样工艺考察L9(34)正交试验

表5 方差分析

由结果可以看出:对有效成分比吸附量的影响因素依次排列为 C＞B＞D＞A，直观分析的最佳上样工艺为A3B1C1D1，但A因素中二、三水平相差不大，且三水平是由二水平浓缩制得，在浓缩的过程中会有少量沉淀产生，如再次离心会造成成分损失，直接上柱会影响流速，增加流速的控制难度。综合以上分析，确定最佳上样工艺为A2B1C1D1。即上样药液浓度为0.3 g生药/mL，体积流量为2 BV/h，pH值为5.0，不加无机盐。

2.5.2 上样工艺验证试验最佳上样工艺试验3次，结果总黄酮比吸附量为(6.85±0.45)mg/mL树脂，绞股蓝皂苷比吸附量为(18.44±0.12)mg/mL树脂，异秦皮啶比吸附量为(359±3)μg/mL树脂，说明最佳上样工艺是可行的。通过验证试验可以确定上样量与大孔树脂量比例为总黄酮≤6.8 mg/mL树脂，绞股蓝皂苷≤18 mg/mL树脂，异秦皮啶≤350 μg/mL树脂。为了保证成分的有效吸附，防止泄漏现象的发生，依据上样药液中的有效成分含量，初步确定药液上样量为70 mL并对此进行试验，结果有效成分未发生泄漏。

2.6 洗脱溶剂浓度的考察

取D-101 大孔树脂18 mL(1.5 cm ×10.5 cm)，上样药液70 mL上柱，用100 mL水洗脱后分别采用30%、50%、70%、90%乙醇各150 mL洗脱，上柱和洗脱液体积流量皆为2 BV/h，收集乙醇洗脱液，测定有效成分，计算洗脱率。绘制不同乙醇浓度对有效成分洗脱率的曲线图，结果见图1。

由图1可以看出，随着乙醇浓度的增加，绞股蓝皂苷洗脱率明显增大，而总黄酮和异秦皮啶洗脱率增加很小。采用30%乙醇洗脱时，总黄酮洗脱率为88.03%，异秦皮啶洗脱率为93.95%，增加乙醇浓度对洗脱率影响很小;30%乙醇对绞股蓝皂苷洗脱率为45.63%，随着乙醇浓度的增加，洗脱率也增加，70%乙醇洗脱率为92.40%，再增加乙醇浓度，洗脱率几乎不增加，该浓度与文献［11］报道一致。综合考虑各成分洗脱率和生产成本，洗脱溶剂确定为70%乙醇。

图1 乙醇浓度对洗脱率的影响

2.7 洗脱溶剂用量的考察

上样药液上柱同2.6项下方法，先用100 mL水洗脱，继以150 mL 70%乙醇洗脱，洗脱液体积流量为2 BV/h，洗脱液每25 mL收集1次。分别测定水洗脱液中浸膏量和70%乙醇洗脱液中有效成分含量。结果表明用水量达到75 mL(约为树脂体积的4倍)时洗脱液中固形物已经很少，故水的用量确定为树脂体积的4倍;70%乙醇用量达到100 mL(约为树脂体积的6倍)时，洗脱液中有效成分已呈微量，所以70%乙醇的用量确定为树脂体积的6倍。