地榆提取物中不同类型鞣质的测定

程 悦， 陈嘉升， 陈建萍， 王冬梅*

(1.中山大学药学院，广东广州 510006;2.香港大学中医药学院，香港)

地榆为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalisL.或长叶地榆Sanguisorba officinalisL.var.longifolia(Bert.)Yü et Li的干燥根，主产于东北、内蒙古、山西、陕西、河南、广西等地。地榆味苦、酸、涩，微寒，归肝、大肠经，用于治疗便血，痔血，血痢，崩漏，水火烫伤，痈肿疮毒等症［1］。鞣质类和三萜类化合物是地榆的主要化学成分，鞣质是其发挥收敛止血作用的物质基础［2］。

鞣质(Tannins)又称单宁，是存在于植物体内的一类结构较复杂的多酚类化合物。K Frendenberg于1920年按照鞣质的化学结构特征将其分为可水解鞣质(hydrolysable tannin)和缩合鞣质(condensed tannin)两大类［3］。可水解鞣质，即没食子酸酯类多酚，是多元醇与没食子酸或与没食子酸有生源关系的酚酸所形成的酯，其分子内具有酯键或苷键，在稀酸、稀碱或酶的作用下易水解，产生多元醇和小分子类酚酸，根据其水解产物的不同，分为没食子鞣质(gallotannin)和鞣花鞣质(ellagitannin)两大类。缩合鞣质，即聚黄烷醇类多酚，是由儿茶素或没食子酸儿茶素等黄烷－3－醇类化合物以碳－碳键聚合而形成的化合物，不被酸所水解，通常三聚体以上才具有鞣质的性质［4］。

地榆中的鞣质类成分量很高，约为17%，从1982 年开始，Nonaka、Tanaka 等［5－9］先后从地榆中分离出没食子酸、鞣花酸、地榆素 H－1、地榆素 H－2、地榆素 H－3、地榆素 H－6、地榆素 H－11、(± )－儿茶素、(±)－没食子酸儿茶素、原花青素 B－3、原花青素 C－2、3－0－没食子酰原花青素 B－3、4，6－O－双没食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷、6－O－双没食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷Ⅰ、6－O－双没食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷Ⅱ、2，3，4，6－O－四没食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷、2，3，6－O－三没食子酰－β－D－吡喃葡萄糖苷和3，4，6－O－三没食子酰－β－D－吡喃葡萄糖苷、1，2，3－O－三没食子酰－β－D－葡萄糖、1，2，3，6－O－四没食子酰－β－D－葡萄糖、2，3，4，6－O－四没食子酰－β－D－葡萄糖、1，2，3，4，6－O－五没食子酰－β－D－葡萄糖等化合物，夏红旻、秦国伟等［10－11］分离出 3，3′，4′－三甲氧基鞣花酸和3－O－甲基没食子酸甲酯。

可水解鞣质和缩合鞣质由于基本组成的不同，药理作用和疗效显著不同，即使同类型的鞣质，结构上的微小差异也可导致活性的巨大差异，为了富集地榆中不同类型的鞣质类成分进行进一步的药效物质基础以及药理活性研究，本实验以可水解鞣质和缩合鞣质作为研究对象，分别测定地榆水提物和各萃取部位的鞣质，采用酸解后HPLC分析的方法测定可水解鞣质，用香草醛硫酸法测定缩合鞣质。

1 材料与仪器

1.1 供试材料

地榆干燥药材，产地广西，购自香港大学中医药学院临床教研中心大药房，经中山大学药学院生药学与天然药化实验室杨得坡教授鉴定为蔷薇科地榆属植物地榆Sanguisorba officinalisL.的干燥根。

1.2 试剂与仪器

TU－1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，HPLC色谱仪:岛津LC－20AB泵、岛津SIL－20A自动进样器、岛津SPD－M20A二极管阵列检测器(日本岛津公司)，Ultimate AQ－C18色谱柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm，美国 Welch 公司)，Millipore超纯水系统。

鞣花酸、没食子酸、儿茶素(美国Sigma公司)，色谱纯乙腈(美国Sigma公司)，石油醚(沸程60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、硫酸、香草醛为国产分析纯试剂。

2 方法与结果

2.1 地榆水提物及各个萃取部位的制备

干燥地榆药材2.5 kg，粉碎，冷水浸泡过夜后，加入10倍水(V∶M)、加热至沸后煎煮1 h，抽滤，滤渣重复煎煮提取1次，抽滤，合并两次提取液，得地榆水提液。

将水提液浓缩至小体积后，除小部分浓缩得水提物约120 g，其余依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对地榆水提液进行萃取，萃取液减压浓缩至干，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水层留余物，得率如表1所示。因石油醚萃取物的得量很少，且不含鞣质类成分，故不对其进行鞣质的测定。

表1 地榆各萃取部位得率Tab.1 The contents of different extracts from Sanguisorba officinalis L.

2.2 地榆水提物及各萃取部位中可水解鞣质的测定

可水解鞣质分子内的酯键或苷键在酸热作用下易水解，产生没食子酸和鞣花酸，因此，本实验采用酸解后HPLC分析的方法［12］，通过测定水解后没食子酸和鞣花酸，来间接反映可水解鞣质的总量。

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取鞣花酸5.22 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤后，为鞣花酸对照品贮备液(208.8 μg/mL);精密称取没食子酸对照品5.00 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤后，为没食子酸对照品贮备液(200 μg/mL)。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取地榆水提物5 mg、乙酸乙酯萃取物 2 mg、正丁醇萃取物 3 mg、水层留余物5 mg，置于5 mL棕色小瓶，加入0.5 mL 2.0 mol/L盐酸溶液，密封，95℃下酸解8 h。结束酸解后，冷却至室温，加入甲醇超声30 min，转移至5 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，为供试品溶液。

2.2.3 色谱条件的选择 以乙腈和0.2%甲酸－水为流动相，乙腈 0 min(5%)－10 min(15%)－25 min(25%)－35 min(30%)－45 min(90%);体积流量 1 mL/min;进样量 20 μL;检测波长254 nm。在该色谱条件下，没食子酸和鞣花酸的保留时间分别为8.81 min和 27.35 min，没食子酸和鞣花酸与样品中其他组分分离良好，理论塔板数均大于5 000，结果见图1。

图1 没食子酸、鞣花酸对照品及乙酸乙酯萃取物酸解后HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of gallic acid，ellagic acid and hydrolyzated ethyl acetate extract

2.2.4 可水解鞣质测定的方法学考察

2.2.4.1 标准曲线和线性范围 精密吸取0.1、0.25、0.5、0.75、1 、1.5、2、3 mL 鞣花酸对照品贮备液于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制浓度为 5.22、10.44、20.88、41.76、62.64、83.52、125.28 μg/mL 的鞣花酸对照品系列溶液;精密吸取 0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2mL没食子酸贮备液于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制浓度为 5、10、20、30、40、50、60、80 μg/mL的没食子酸对照品系列溶液。按2.2.3项下色谱条件进行分析，分别以对照品没食子酸、鞣花酸的浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标进行回归分析。

结果显示，鞣花酸浓度在 5.22 ～125.28 μg/mL范围内线性良好，回归方程为:Y=167 410X－463 853，r2=0.998 8;没食子酸浓度在 5.00 ～80.00 μg/mL范围内线性良好，回归方程为:Y=21 461X+23 487，r2=0.999 7。

2.2.4.2 精密度试验 在2.2.3项下色谱条件，分别将鞣花酸和没食子酸对照品溶液重复进样6次，测得鞣花酸和没食子酸峰面积的RSD分别为0.13%和0.04%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.3 重复性试验 称取地榆乙酸乙酯萃取物2 mg共6份，按2.2.2项下制备供试液样品，按2.2.3项下色谱条件进行分析，测得鞣花酸和没食子酸质量分数均值分别为57.63 mg/g和149.33 mg/g，RSD分别为0.71%和0.98%，表明该方法重复性良好。

2.2.4.4 稳定性试验 称取地榆乙酸乙酯萃取物2 mg，按2.2.2项下制备供试液样品，配制后分别于第0、1、2、4、8、16、24 h 进样 7 次，按 2.2.3 项下色谱条件进行分析，测得供试品中的鞣花酸和没食子酸峰面积的RSD分别为0.31% 和0.20%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.4.5 加样回收率试验 精密称取已知量的地榆乙酸乙酯萃取物9份，每份约1.2 mg，分别加入不同量的鞣花酸和没食子酸对照品溶液，制备3个不同浓度的样品，每个浓度平行3份，按2.2.2项下制备供试液样品9份，按2.2.3项下色谱条件进行分析，结果如表2所示，鞣花酸与没食子酸加样回收率分别为 100.36% 和 102.77%，RSD值分别为1.45%和1.20%，表明该方法的准确度良好。

2.2.5 地榆水提物及各萃取部位中可水解鞣质的测定 分别称取地榆水提物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水层留余物各3份，按照按2.2.2项下制备供试液样品，按2.2.3项下色谱条件进行分析，测定供试品中没食子酸和鞣花酸的量，结果如表3所示。

2.3 地榆水提物及各萃取部位中缩合鞣质的测定

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取儿茶素对照品52.59 mg置于50 mL量瓶中，用甲醇溶剂并稀释至刻度，摇匀，为对照品贮备液(1.051 8 mg/mL)。

2.3.2 供试品溶液的制备 称取地榆水提物 5 mg、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物样品各2 mg，水层留余物50 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇，超声溶解后，用甲醇稀释至刻度，摇匀，为供试品溶液。

2.3.3 缩合鞣质测定方法 采用香草醛硫酸法［13］，取供试品溶液0.5 mL，加入包有锡箔的试管中，分别加入2.5 mL 3%香草醛甲醇溶液和2.5 mL 30%浓硫酸甲醇溶液，摇匀，避光显色20 min后，在500 nm处测定吸光度A500。

表2 加样回收率试验(n=9)Tab.2 Results of recovery test(n=9)

表3 地榆水提物及各萃取部位的可水解鞣质测定Tab.3 Contents of hydrolysable tannins in the aqeous extract of Sanguisorba officinalis L and its different solvents partitioned extracts

2.3.4 缩合鞣质测定的方法学考察

2.3.4.1 标准曲线和线性范围 精密量取儿茶素对照品贮备液 0.5、1、2、3、4、5 mL 分别置于 10 mL量瓶中，分别加入甲醇稀释定容至刻度，摇匀，备用。分别取上述各浓度对照品溶液0.5 mL，按2.3.3项下测定，以对照品溶液的浓度(X，mg/mL)为横坐标，对照品吸光度值A500(Y)为纵坐标，进行回归分析。结果显示，儿茶素对照品浓度在0.054 1～0.525 9 mg/mL范围内线性良好，回归方程为Y=2.252 3X－0.107 7，r2=0.999 1。

2.3.4.2 精密度试验 取对照品溶液0.5 mL，按2.3.3项下测定，连续测定 6次 A500，RSD 为0.20%，表明仪器精密度良好。

2.3.4.3 重复性试验 精密称取1 mg地榆乙酸乙酯萃取物6份，按2.3.2 项下制备供试液，按 2.3.3项下测定 A500，计算缩合鞣质均值为593.55 mg，RSD为1.70%，表明该方法重复性良好。

2.3.4.4 稳定性试验 精密称取地榆乙酸乙酯萃取物1 mg，按2.3.2项下制备供试液，同一供试品溶液分别于第 0、1、2、4、8、24 h 按 2.3.3 项下测定A500，共测定6次，RSD为1.32%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4.5 加样回收率试验 称取1 mg已知质量分数的地榆乙酸乙酯萃取物9份，分别加入不同质量分数的儿茶素对照品溶液，制备3个不同浓度的样品，每个浓度平行3份，按2.3.2项下制备供试液样品9份，按2.3.3项下测定A500，结果如表4所示，儿茶素的加样回收率为99.37%，RSD值为1.06%，表明该方法的准确度良好。

2.3.5 地榆水提物及各萃取部位中缩合鞣质的测定 分别称取地榆水提物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水层留余物各3份，按照按2.3.2项下制备供试液样品，按2.2.3项下测定A500，结果如表5所示。

3 讨论

3.1 地榆水提物及各个萃取部位鞣质量的差异

由以上结果可知，所含可水解鞣质和缩合鞣质量高低顺序均为:乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞水提物＞水层留余物。可水解鞣质和缩合鞣质在乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中量较高，这说明乙酸乙酯和正丁醇萃取均可使两种类型鞣质类成分得到富集，尤其是没食子鞣质和缩合鞣质的富集效果显著，乙酸乙酯萃取物中没食子鞣质和缩合鞣质的量分别是水提物中量的7.1倍和3.2倍，正丁醇萃取物中没食子鞣质和缩合鞣质的量分别是水提物中量的4.9倍和2.6倍。

表4 加样回收率试验(n=9)Tab.4 Results of recovery test(n=9)

表5 地榆水提物及各萃取部位的缩合鞣质测定Tab.5 Content of condensed tannins in the aqeous extract of Sanguisorba officinalis L and its different solvents partitioned extracts

3.2 地榆不同鞣质测定方法的优缺点

可水解鞣质的测定，采用酸解后HPLC分析的方法，其原理是在酸热作用下，多酚分子内的酯键或苷键易水解，产生没食子酸和鞣花酸，用HPLC法可以准确测定多酚水解后生成的酚酸，其优点在于准确度高，灵敏度好，不受其他物质的干扰。

缩合鞣质的测定采用香草醛硫酸法，其原理在于酸性条件下黄烷醇类多酚组成单元儿茶素的A环上的羟基能与香草醛发生缩合反应，在一定浓度范围内，该显色物质在一定的吸收波长处的吸光度与缩合鞣质的浓度成正比，其优点在于其线性最好，而且测量值最接近于标准品的真实值［14］，经过显色反应条件优化试验，最终确定香草醛甲醇溶液浓度为3%，浓硫酸甲醇溶液浓度为30%，避光显色20 min为反应条件。

2010版中国药典中的鞣质的测定方法［15］，其原理是多酚结构中的酚羟基能够还原钨钼酸生成蓝色化学物质，根据此原理分别测定总酚与不被吸附的多酚量，鞣质量即为总酚与不被吸附多酚的量之差，此法比较稳定，重现性好，因而成为测定与蛋白结合鞣质量的经典方法，但此方法并不能区分可水解鞣质和缩合鞣质。

本试验采用的酸解后HPLC分析和香草醛硫酸法分别测定两种不同类型鞣质的量，方法简便、快速、精密度、稳定性、重现性、专属性好，适合作为中药或天然药物中不同类型鞣质的测定方法。

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