基于微量量热法表征的茵栀黄注射液质量波动评价方法研究

张 萍， 任永申， 鄢 丹， 段慧娟， 李正明， 肖小河*

(1.解放军中药研究所解放军第三0二医院，北京 100039;2.成都中医药大学 药学院，四川 成都 610075;3.军医进修学院研究生队，北京 100853)

中药注射剂是我国传统医学理论与现代科学结 合的产物，它开辟了中药新的给药途径，提高了中药治疗临床急重症的疗效，成为中药现代化成果的代表，其中诸如清开灵注射液、茵栀黄注射液等都以优良的疗效成为临床常用品种，并成为医院药品采购的重点。近年来，关于中药注射剂不良反应的事件和报道却不断攀升，给中药注射剂的进一步研发和应用蒙上了一层阴影。2008年报道的茵栀黄注射液严重不良反应事件，直接导致了该批号注射液的停用，在业内引起了强烈的反响，促发了人们对中药注射剂的质量问题和合理用药的新认识。

茵栀黄注射液是由茵陈、栀子、金银花、黄芩等药物组成的中药复方制剂，具有清热、解毒、抗菌、消炎及增强机体免疫功能等药理作用，常用于治疗肝胆湿热、小便黄赤、急慢性肝炎等病症［1］，其临床应用广泛且疗效显著［2-3］。然而，其不良反映的发生已给人们以警示:有必要对该注射液安全性和稳定性进行客观真实的评价。

为进一步提高茵栀黄注射液的临床应用价值，我们从质量一致性和稳定性出发，针对该注射液的抗菌作用，采用微量量热法［4-6］考察了7批石家庄神威药业生产的茵栀黄注射液对金黄色葡萄球菌生长代谢的影响，以细菌的生长代谢曲线和定量热动力学参数为指标，结合主成分分析和聚类分析，比较和分析了7批注射液的抗菌作用和质量差异，为该注射液安全性和稳定性评价提供了方法和模式参考。

1 仪器与方法

1.1 仪器 采用瑞典Thermometric公司产的3114/3236型TAM Air Isothermal Calorimeter微量量热仪测定金黄色葡萄球菌的生长热谱曲线。该热活性检测仪配置Pico TC-80数据采集和分析软件，可同时独立测定8个样品。其热稳定性好，热功率检测限低，且基线稳定。其它有关仪器结构原理及操作详见文献［7］。

1.2 材料 菌株:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)CMCC(B)26 003，由中国药品生物制品检定所提供。培养基:LB液体培养基，取NaCl 10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，溶解于1 000 mL去离子水中，调pH7.0～7.2后分装。121℃高压蒸气灭菌30 min，冷却后置4℃冰箱中保存备用。

1.3 样品 石家庄神威药业(SW)生产的茵栀黄注射液合格样品共7批，其生产批号及规格详见表1。

表1 样品信息Tab.1 Sample information of Yinzhihuang Injection

1.4 方法 采用安瓿法，在无菌条件下，向参比池各20 mL安瓿瓶内分别加入10 mL已灭菌去离子水作为参比。反应池各安瓿瓶中精确加入10 mL LB培养基(其中已接种1.0×106CFU/mL的金黄色葡萄球菌)，然后分别加入100 μL(1%，v/v)各批茵栀黄注射液，加盖瓶塞密封，放入微量量热仪中跟踪记录金黄色葡萄球菌生长代谢热谱曲线(Power-time，P-t曲线)，系统控温于37℃，上述均为无菌操作。当曲线重新返回基线时，实验结束。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌的生长热功率输出曲线

37℃下，安瓿法测定了100 μL(1%，v/v)各批次茵栀黄注射液作用下金黄色葡萄球菌的生长代谢曲线，见图1。

图1 茵栀黄注射液样品作用于金黄色葡萄球菌的热功率-时间曲线Fig.1 The power-time curve of S.aureus affected by Yinzhihuang Injection

结合Kong等［8］报道，金黄色葡萄球菌的生长代谢曲线可以划分为5个生长期:停滞期、第一指数生长期、过渡期、第二指数生长期和衰亡期。分别对应于细菌对培养基中不同营养成分的利用情况及不同的代谢过程。从图中曲线的两个最高峰的出峰时间和高度可以看出，不同批次的茵栀黄注射液对金黄色葡萄球菌的生长代谢有不同的影响，这也提示我们，采用该方法研究各批次注射液对该细菌的影响以评价茵栀黄注射液的抗菌作用有一定的合理性。

2.2 金黄色葡萄球菌生长代谢的热动力学参数在细菌细胞的生长过程中，其指数生长期内的产热功率与培养时间之间符合公式［9］:Pt=P0exp(kt)或lnPt=lnP0+kt。

其中，P0，Pt分别是细菌在指数生长的起始点和t时刻的热输出功率。将lnP和t进行线性拟合可以得到金黄色葡萄球菌指数生长期的生长速率常数k;对各曲线下面积进行积分可以得到细菌生长过程中的产热量Q，见表2。其中k1和k2、P1和P2、t1和t2分别为第一和第二指数生长期的生长数率常数、两个最高峰的输出功率和出峰时间。

图2的柱状图更直观和快速地呈现了各批次注射液作用下金黄色葡萄球菌生长代谢热动力学参数的变化情况。

表2 茵栀黄注射液作用的金黄色葡萄球菌生长热动力学参数Tab.2 The thermokinetics parameters of S.aureus affected by Yinzhihuang Injection

图2 7批茵栀黄注射液样品作用于金黄色葡萄球菌的生物热动力学参数柱状分析图Fig.2 The chart for the thermokinetics parameters of S.aureus affected by Yinzhihuang Injection

图2显示，相对于空白对照(不加注射液)组，各批次注射液作用下金黄色葡萄球菌生长代谢曲线的最高峰出峰时间变化不明显，而生长速率常数、最大输出功率和总产热量变化显著，但是变化规律不一致，难以准确分析和比较注射液的抗菌作用。为此，我们引入主成分分析和聚类分析的分析方法，客观有效地评价不同批次注射液的抗菌作用规律和内在质量的一致性和稳定性。

2.3 主成分分析 主成分分析［10-12］是用于研究试验考察因素与多个变量间关系的一种多元统计学方法，其采用主成分分析思想，将多元变量压缩为2个对全数据集贡献度大致相等的主成分变量Z1和Z2，然后根据标准化表达式计算出各数据点的主成分变量集［Z1，Z2］，再将各数据组的主成分均值绘在坐标系上实现二维空间投影，从而直观表达出试验考察因素的内在变化规律。本文采用SAS统计软件［10］对表2中数据进行主成分分析，结果表明Z1和Z2分别可解释原来7个变量(定量热动力学参数52.5%和24.75%的信息，累积解释77.25%的原信息，提示构建的2个主成分可较好的表达原来7个热动力学参数反应的各批次注射液的抗菌作用。2个主成分的表达式分别为:

上式中热动力学参数前系数的绝对值表示该参数对主成分的贡献大小，正负符号表示影响方向。由热动力学参数对两个主成分的共同贡献率可以看出，分析第一指数生长期的生长速率常数k1和整个生长过程的产热量Q的数值变化，可以较快地评价7批注射液的抗菌作用差异:相对于空白对照(不加药液)组，7批注射液均有抗金黄色葡萄球菌的作用，且其作用强度为，S5＞S7＞S3＞S6＞S4＞S2＞S1。为了能更直观地反映这一规律，本文以空白对照组为坐标原点将主成分坐标系进行了平移做出了前两个主成分的二维投影图，见图3(图中用不同图例符号用以区分各批次样品)。从图中可以看出:以正常组为中心，各批次样品与正常组的距离不同。各样品距离远点的距离远大，其抗菌作用越强。图3也更直观表明7批注射液的抗菌的作用强度为:S5＞S7＞S3≥S6＞S4＞S2＞S1。

图3 7批茵栀黄注射液抗菌活性分布图Fig.3 The antibacterial activity profile of 7 batches of Yinzhihuang Injection

2.4 聚类分析 上述的分析结果表明了7批次注射液的抗菌作用差异和程度强弱，但是，却未能反映出此7批注射液内在质量的一致性和稳定性。为此，我们引入了聚类分析的分析方法。以表2中热动力学参数值为指标，采用SPSS 13.0软件对7批注射液进行聚类分析，结果见图4。

结果显示，7批样品首先被分为两大类，S5单独成类，为2007年1月生产的某批产品，结合主成分分析结果可以得出，此样品的抗菌作用最强，且质量最稳定，其余6批样品聚为一类，表明其内在质量有一定的相似性，但是没有S5样品稳定。进一步分析表明，此6批样品又可被分为两类，其中S1单独成类，为2006年6月生产的某批产品，结合主成分分析结果可以得出，此样品的抗菌作用最弱，但质量较稳定;其余5批样品的抗菌作用和内在稳定性较为相似。

图4 7批茵栀黄注射液样品聚类分析图Fig.4 The cluster analysis of 7 batches of Yinzhihuang Injection

3 讨论

微量量热法是基于生化反应中普遍存在的热交换而建立的，它能在不干扰生物体系的正常活动和代谢的情况下，直接监测生物体系代谢过程中的热效应，实时、在线、动态、量化地获得微生物生长代谢过程中的整体信息，从而反映其他物质对该微生物的干预作用和药效强弱，从而有效地弥补了常规方法信息单一的不足［13］。

金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌的典型代表，在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，是自然界的优势菌群。其营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4，适用于生物热动力学研究及其它药物的抗菌作用评价。任永申等［14-15］采用微量量热法分析和比较了多种微生物的生长代谢情况，结果表明，金黄色葡萄球菌的生长周期相对较短，能够更快速的实现对样品的检测，故本研究选用该细菌为生物模型评价茵栀黄注射液的抗菌作用。

微量量热法记录的茵栀黄注射液作用下金黄色葡萄球菌的生长代谢曲线和热动力学参数的变化，直观、快速地反映了7批次注射液对该细菌的影响;主成分分析结果显示第一指数生长期的生长速率常数k1和整个生长过程的产热量Q的数值，可以反应各批注射液的抗菌作用差异，且其抑菌作用强度顺序为，S5＞S7＞S3＞S6＞S4＞S2＞S1。聚类分析结果表明，抗菌作用最强的S5样品的内在质量最稳定，强于S7和S6样品;抗菌作用最弱的S1样品的内在质量最不稳定，弱于S2和S3样品。以上结果综合表明，茵栀黄注射液虽然同为同一药厂的产品，但是生产时间、生产批次等因素对产品的抗菌作用和内在质量和稳定性存在一定的影响。为此，笔者建议，针对注射液的不良反应和事件频发的情况，药厂在生产产品应严格控制生产过程、生产环节及其相关因素，且产品在出厂时应严格检查，确保安全。

本实验采用微量量热法，以金黄色葡萄球菌为模式生物，细菌的生长代谢曲线和定量热动力学参数为指标，结合统计学分析，比较7批茵栀黄注射液的抗菌作用和内在质量差异，为该注射液的质量一致性和稳定性评价提供了方法和模式参考，有望为中药注射剂的安全使用提供技术指导。

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