灵芝酸单体Me肠溶胶囊制备及其兔体内生物利用度测定

陶少林， 陈 香， 高 峰*， 钟建江

(1.华东理工大学上海市功能性材料化学重点实验室，上海 200237;2.华东理工大学药学院药剂教研组，上海 200237;3.上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240)

灵芝酸具有抗肿瘤、抗HIV-1病毒、调节免疫、镇痛等功效，是灵芝的主要有效成分之一［1-2］，是当今研究的一大热点。灵芝酸单体Me(简称GA-Me)具有抗小鼠 Lewis肺癌作用［3］，通过调节 IL-2和IFN-γ的表达，增强NK细胞活性，提高机体免疫水平，抑制肿瘤生长［4］。同时，GA-Me对机体免疫有一定的调节作用。由于GA-Me水难溶性和在酸性条件下易降解，使得口服给药生物利用度较低［5］，影响其疗效。β-环糊精(简称β-CD)包合物载药系统是近年来发展起来的新方法，能有效提高难溶性药物生物利用度［6］。我们制备了GA-Me-β-CD包合物肠溶胶囊，并对本品在兔体内的药代动力学进行了研究。

1 仪器与材料

电子分析天平(AB104-N，梅特勒-托利多仪器)，LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津公司)，紫外-可见分光光度仪(TU-1800SPC，北京普析通用仪器有限责任公司)，80-2型离心机(上海蓝凯仪器仪表有限公司)，LX-200离心机(海门市齐林贝尔仪器厂)，WH-微型涡旋混合仪(上海精科实业有限公司)，微量定量移液器(上海求精生化试剂仪器有限公司)，恒温水浴箱(上海蓝凯仪器仪表有限公司)。

GA-Me(纯度＞99%，华东理工鲁华生物所);苯丙酸诺龙(纯度＞99%，上海顺勃生物工程技术有限公司);β-CD(国药集团上海化学试剂公司);微晶纤维素(常熟市药用辅料有限公司);微粉硅胶(常熟市药用辅料有限公司);2号肠溶空胶囊(无锡长江胶囊有限公司);甲醇、乙酸、水为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

新西兰兔(体质量2.2～2.7 kg)，购于复旦大学实验动物科学部，合格证号 SCXK(沪)2010-0011。

2 方法与结果

2.1 GA-Me-β-CD包合物制备 称取一定量的β-CD置于研钵中，加入约占β-CD质量10% ～20%的水研磨5 min，使之成糊状物。称取计算量的GAMe溶解于乙醇加于研钵中，继续研磨3 h，真空干燥备用。当主客分子比分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1时，包合物质量浓度分别为(1.64 ±0.30)、(2.41 ±0.15)、(5.28 ±0.64)、(3.33 ±0.20)μg/mL。选择主客分子比为3∶1制备包合物。

2.2 包合物量测定

2.2.1 测定波长的选择 精密称取 GA-Me 1 mg置10 mL量瓶中，加80%乙醇溶液定容，摇匀得GAMe标准溶液。在200～400 nm波长范围内对β-CD、GA-Me及其包合物的80%乙醇液进行扫描。结果表明GA-Me在245 nm处有最大吸收，β-CD和包合物在此波长处无吸收。选择245 nm作为GAMe含量测定的检测波长。

2.2.2 标准曲线的制备 精密量取适量GA-Me标准溶液至100 mL量瓶中，加80%乙醇溶液定容至GA-Me 质量浓度分别为 0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10、20、40 μg/mL，在245 nm处测定吸光度。以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，经线性回归后得标准曲线方程为y=0.027 4x+0.023 1，r=0.999 8。GA-Me质量浓度在0.5～40 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 包合物中药物含量测定 精密称取包合物约7 mg置100 mL量瓶中，加入80%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤后在245 nm处测定吸光度，代入标准曲线计算药物量。结果表明7 mg包合物中GA-Me量为0.88 mg，在包合物制备过程中有12%的GA-Me降解。

2.3 包合物溶解度的测定 取过量GA-Me及其包合物分别置于10 mL具塞刻度试管中，加水适量，于室温下振摇使之充分溶解达到平衡，离心后上清液0.45 μm微孔滤膜过滤，续滤液于245 nm处测定吸光度，代入标准曲线计算GA-Me在水中的溶解度。取3个批号包合物进行测定。GA-Me溶解质量浓度为(1.06 ±0.12)μg/mL，包合物溶解质量浓度为(5.28 ±0.64)μg/mL，溶解度提高了5 倍。

2.4 GA-Me-β-CD包合物肠溶胶囊的制备

2.4.1 GA-Me酸碱稳定性 配置pH值1～12系列水溶液，精密量取适量GA-Me标准溶液使得质量浓度均为25 μg/mL，每个pH配3个样品，置于棕色玻璃瓶中。在不同时间点测定各pH值下GA-Me的量。结果表明5 min内GA-Me在pH值1～3条件下含量下降55% ～63%，在pH值6～8条件下含量下降1%～3%，提示制剂开发过程中应采用肠溶胶囊以避免胃液对GA-Me及其包合物的破坏作用。

2.4.2 肠溶胶囊的制备 以休止角作为粉末粒度选择依据选择包合物粉末粒度;选择微晶纤维素为填充剂并加入适量微粉硅胶，以改善粉末的流动性和提高抗湿性能;选择2号肠溶胶囊，150 mg作为单位胶囊剂。采用等量递加法将包合物与微晶纤维素及微粉硅胶混合、过80目筛、填装制得肠溶胶囊。

2.5 肠溶胶囊中主药量的测定

2.5.1 标准曲线的制备 取空白胶囊10 mg溶解于50 mL 80%乙醇溶液中，在此溶液中加入适量GA-Me标准溶液，配置成GA-Me质量浓度分别为0.0、2.5、5.0、10、20、40 μg/mL 的溶液，在 245 nm处测定吸光度。以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，经线性回归后得标准曲线方程为y=0.026 9x+0.028 1，r=0.999 7。GA-Me 质量浓度在 2.5 ～40 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5.2 主药含量测定 取3个批号的包合物胶囊各10 mg溶解于50 mL 80%乙醇溶液中测定GA-Me的量。结果表明每个单位胶囊剂中GA-Me量均在20 mg左右，RSD小于1.6%，不同批次胶囊之间的主药量差异较小。

2.6 体外溶出度试验

2.6.1 溶出介质的选择 随着表面活性剂(十二烷基硫酸钠，SDS)含量增大，GA-Me溶解度逐渐增大;在含0.3%SDS的溶出介质中，可满足释放度测定的漏槽条件，选择含0.3%SDS的人工胃液(pH 1.2的盐酸溶液)、人工肠液(pH 6.8的磷酸盐缓冲液，PBS)作为溶出介质。

2.6.2 色谱条件［7］色谱柱为迪马公司 Diamonsil®C18(250 mm ×4.6 μm，5 μm);流动相:甲醇-水(94∶6，用乙酸调pH至3.6);体积流量:1 mL/min;检测波长:245 nm;柱温:室温;进样量:20 μL。

2.6.3 样品处理 定时取样2 mL，0.22 μm 微孔滤膜过滤，同时立即补加等量的溶出介质，精密取滤液0.5 mL，2 mL乙酸乙酯萃取，取上层有机相0.5 mL，40℃氮气吹干，残留物用流动相200 μL溶解，待测。

2.6.4 标准曲线制备 精密量取适量GA-Me标准溶液分别置于10 mL量瓶中，用PBS稀释至GA-Me质量浓度分别为 0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL，摇匀作为供试品。按照2.6.2项下色谱条件分别进样，记录色谱图，以GA-Me峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标进行线性回归，得标准曲线方程为:y=33 628x+1 673.3(r=0.999 7)。结果表明，GAMe质量浓度在 0.5 ～8.0 μg/mL 范围内线性关系良好。平均回收率为98.07%，RSD为5.23%。

2.6.5 溶出度测定 按照转篮法操作，每个操作容器中注入900 mL经脱气处理的溶出介质，控制温度在(37±0.5)℃，调整转速至100 r/min。取本品胶囊一粒，用一小段耐腐蚀的金属线轻绕胶囊外壳使其沉入底部，立即启动机器，定时取样2 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，按照2.6.3项下操作并进样检测，计算溶出度，绘制溶出曲线(图1)。结果表明转速为100 r/min时，在人工胃液中2 h药物释放百分率＜2%，在人工肠液中45 min时的溶出度均超过了标示量的80%，符合药典规定。

图1 GA-Me-β-CD包合物肠溶胶囊累积溶出曲线(n=5)Fig.1 The accumulative release curve of enteric-coated capsules of GA-Me-β-CD inclusion complex(n=5)

2.7 高温高湿影响实验 将包合物胶囊用自封袋简单包装，分别置于60℃、25℃、RH75%的密闭条件下于5、10 d取样，测定胶囊中GA-Me量及1 h溶出度情况，并与0 d结果比较［8］。结果表明GA-Me肠溶胶囊在高温及高湿条件下稳定，含量、外观无明显变化，但累积溶出量分别下降了4.34%、6.13%。提示包合物肠溶胶囊应注意密封包装，且在低温及干燥条件下保存。

2.8 兔体内血药浓度的测定

2.8.1 色谱条件 参考2.6.2项色谱条件。采用内标法，内标物为苯丙酸诺龙。

2.8.2 溶液配置 精密称取GA-Me、苯丙酸诺龙各5 mg置10 mL塑料离心试管中，加甲醇5 mL溶解，摇匀，得1 mg/mL的标准溶液，临用前加流动相稀释至浓度，置冰箱4℃保存备用。

图2 (a)空白血浆、(b)空白血浆中加入GA-Me(2)和苯丙酸诺龙(1)及(c)兔静脉给药1 min后血浆样品色谱图Fig.2 Chromatograms of blank plasma from a rabbit(a)，of plasma spiked with GA-Me(2)and nandrolone phenylpropionate(1)(b)，and of plasma sample from a subject 1 min after intravenous administration(c).

2.8.3 血液样品的处理 将血样置于涂有肝素钠的离心管中，12 000×g离心3 min，取上层血浆250 μL(口服时取500 μL)，加入内标及药物溶液共50 μL，内标终质量浓度为10 μg/mL，添加乙腈 1 mL，涡旋2 min，7 000 r/min离心20 min后精密量取上层0.9 mL(口服时1.2 mL)于另一只试管中，40 ℃氮气吹干，流动相200 μL溶解，取20 μL注入高效液相色谱仪记录色谱图。根据峰位判断，保留时间在9 min左右的色谱峰为GA-Me的色谱峰，保留时间在7 min左右的色谱峰为内标物的色谱峰。结果表明，血浆内原性物质不干扰测定，内标与药物色谱峰分离度符合测定要求，峰形对称。

2.8.4 标准曲线和灵敏度 精密量取适量GA-Me及内标溶液共50 μL 至250 μL(口服时取500 μL)血浆中，使 GA-Me 质量浓度分别为 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 μg/mL，内标终质量浓度为 10 μg/mL，按 2.8.3 项操作，测定标准曲线。以GA-Me质量浓度为横坐标，GA-Me与内标峰面积比值为纵坐标，经线性回归得静脉给药标准曲线为:y=0.042 4x+0.012 1(r=0.999 6)，口服给药标准曲线为:y=0.126x+0.001 8(r=0.998 5)。结果表明 GA-Me质量浓度在0.05 ～51.2 μg/mL范围内线性关系良好，最低检测限为0.05 μg/mL。

2.8.5 方法回收率与精密度 取空白血浆分别加入 GA-Me及内标溶液，使 GA-Me成 0.05、0.2、40 μg/mL各质量浓度，内标终质量浓度为10 μg/mL，按2.8.3项操作后进样，记录色谱图。3种质量浓度的平均回收率分别为 96.7%、99.4%、99.2%。连续测定5日。日内、日间RSD均小于8.8%，符合生物样本测定方法的要求。

2.8.6 稳定性 取空白血浆分别加入GA-Me及内标溶液，使 GA-Me 成0.05、0.2、40 μg/mL 各质量浓度，内标终质量浓度为10 μg/mL，置于4℃保存10 min和12 h，－20 ℃保存12 h后，按 2.8.3项操作后进样，记录色谱图。结果表明10 min内样品保持稳定，回收率大于97%，12 h后样品回收率小于75%，建议尽快处理血液样品，药物在10 min内转移到有机相中可以保证实验结果的准确性。

2.8.7 药动学参数 分别对9只兔(体质量为2.3～2.7 kg)静脉注射(GA-Me，1.5 mg/kg)和口服(GA-Me，7 mg/kg或一粒肠溶胶囊，含 GA-Me 20mg)给药，分别在 0、1、3、5、10、15、30、60、120、180、240、360、480、1 440 min(静脉注射)和 0、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480、1 440 min(口服给药)从耳缘静脉取血，按照2.8.3项血液样品处理方法，采用HPLC方法测定GA-Me浓度，以不同时间测得的血浆中GA-Me量的平均值对时间t作图，得两种给药途径下GA-Me的血药浓度-时间曲线。用kinetica 4.4药物动力学程序处理数据(见表1)，结果表明口服GA-Me符合三室模型，GA-Me静脉注射与口服GA-Me-β-CD包合物肠溶胶囊符合二室隔室模型。

表1 静脉注射GA-Me(1.5 mg/kg)和口服GA-Me、肠溶胶囊(7 mg/kg)药动学参数(±s，n=3)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of GA-Me in rabbit plasma following a single dose of intravenous administration(1.5 mg/kg)，oral administration of GA-Me(7 mg/kg)or enteric-coated capsules of GA-Me-β-CD inclusion complex(7 mg/kg).Data were presented as ± s(n=3)

表1 静脉注射GA-Me(1.5 mg/kg)和口服GA-Me、肠溶胶囊(7 mg/kg)药动学参数(±s，n=3)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of GA-Me in rabbit plasma following a single dose of intravenous administration(1.5 mg/kg)，oral administration of GA-Me(7 mg/kg)or enteric-coated capsules of GA-Me-β-CD inclusion complex(7 mg/kg).Data were presented as ± s(n=3)

参数 单位 静脉注射0.39 ±0.07 0.59 ±0.09 tmax min — 49.45 ±8.91 131.45 ±3.48 AUC0-24 h μg·min/mL 237.08 ±8.25 240.04 ±8.31 308.98 ±53.60 t1/2α min 2.88 ±0.36 4.06 ±1.02 79.28 ±5.04 t1/2β min 57.96 ±6.94 50.61 ±8.20 787.45 ±349.57 t1/2γ min — 5 148.40 ±909.95 —Vc L/kg 0.08 ±0.02 2.42 ±0.65 4.91 ±0.92 CL mL/(kg/min) 6.34 ±0.02 6.60 ±1.28 23.30 ±3.70 F%—肠溶胶囊Cmax μg/mL —口服给药GA-Me 21.70 ±0.75 27.93 ±4.84

3 讨论

包合物的制备方法有饱和水溶液法、超声法、研磨法及冷冻干燥法等［9］。本实验根据GA-Me的理化性质，采用研磨法制备GA-Me-β-CD包合物，提高了GA-Me在水中溶解度。为进一步避免胃液对药物的分解作用，将GA-Me-β-CD包合物与适量辅料混合后直接填装肠溶胶囊，该胶囊溶出度、含量测定、稳定性等评价项目均符合药典要求。单次服用GA-Me-β-CD包合物肠溶胶囊，与GA-Me原药口服给药相比，口服生物利用度有增大的趋势，但没有显著增加，GA-Me在酸性条件下含量迅速下降，可能是由于GA-Me大量析出与少量分解所致。制成GA-Me-β-CD包合物肠溶胶囊，改善了GA-Me的口服生物利用度［10］。本研究为灵芝酸的临床前研究提供了实验数据。

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