红花黄色素粉针剂中羟基红花黄色素A血浆蛋白结合率的研究

王建明， 邹 恬， 张媛媛， 范 宁

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040)

红花系菊科红花属植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥花，为活血化瘀中药。现代医学中用于预防和治疗冠心病、心肌梗死和脑血栓等中老年疾病。研究表明，红花的主要成分是红花黄色素［1-2］，红花黄色素的主要成分为羟基红花黄色素A(HSY A)，它具有抗凝、抗缺氧、降血压、改善心脑血管供血不足等作用，临床可用于防治心肌缺血脑缺血、冠心病、脑血栓等疾病［3-6］。血浆蛋白结合率是药物体内重要参数之一，影响药物在体内的分布、排泄和代谢速率，对药物消除半衰期也有影响，与药物药理作用强度关系密切［7］。本实验在已进行HSY A在家兔体内药动学研究的基础上，对其血浆蛋白结合率的进行测定，目的是评价HSY A与血浆蛋白的结合状况，确定HSY A的血浆蛋白结合率以便为HSY A的人体药动学研究奠定基础，为红花黄色素粉针剂在临床上的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器 Waters 600高效液相色谱仪;检测器:Wters 2487;Empower色谱工作站;Diamonsil C18柱(迪马公司);高速冷冻离心机KDC-160HR(科大创新股份有限公司中佳分公司);超滤离心管(美国MILLIPORE);AG135型电子天平(瑞士METTLERTOLEDO公司);XW-80A旋涡混合器(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.1.2 试剂与药品 HSY A对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号:111637-200503);红花冻干粉针剂(哈尔滨三精制药有限公司提供，批号:050528);甲醇、异丙醇、磷酸(购于哈尔滨化学试剂采购供应站，分析纯);乙腈、甲醇(美国产，色谱纯);氯化钠注射液(由黑龙江中医药大学临床医学院提供);超纯水(自制)。

1.1.3 实验动物 大耳白家兔(黑龙江中医药大学GLP中心提供)。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取HSY A对照品1 mg，置5 mL量瓶中，用水定容至刻度，配制成质量浓度为0.2 mg/mL的HSY A对照品溶液备用。

1.2.2 注射剂溶液的制备 精密称取红花粉针剂粉末120 mg，用生理盐水溶解，配制成质量浓度为55.0 mg/mL的HSY A生理盐水溶液备用。

1.2.3 含量测定色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流动相:甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液(35∶2∶63);体积流量:1 mL/min;波长:403 nm;柱温:40 ℃;进样量:20 μL。

1.2.4 血浆样品的处理 处理方法为固-液萃取法。先对萃取柱进行活化和平衡，依次用1 mL水、1 mL异丙醇、1 mL甲醇、3 mL蒸馏水反相冲洗，再以1 mL蒸馏水正向冲洗，最后压出全部液体。

图1 羟基红花黄色素A色谱图

取100 μL 血浆样品加水100 μL，涡旋混和30 s后上样，以1 mL水冲洗弃去，再以1 mL甲醇洗脱后收集并定容至1 mL，待测。

1.2.5 色谱条件专属性的考察 在1.2.3项的色谱条件下，依次进样(空白血浆、羟基红花黄色素A对照品溶液、血浆样品溶液、血浆样品+对照品溶液)，羟基红花黄色素A的保留时间在7 min左右，分离效果良好，空白血浆无干扰，见图1。

1.2.6 标准曲线及线性范围 在0.5 mL空白血浆中加入0.5 mL一系列浓度的对照品溶液，使血浆中HSY A 质量浓度分别为 10、50、100、150、200、250 μg/mL，涡旋混合1 min，按照上述血浆样品处理方法处理后，经高效液相方法分析测定。以血浆样品中HSY A的质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。

标准曲线回归方程为:Y=13 901X+3 572.6(r=0.999 9)，线性范围为 10 ～250 μg/mL，线性关系良好。

1.2.7 方法学回收率的考察 取空白家兔血清3份，加入不同浓度的HSY A对照品溶液，分别配制成低50 μg/mL、中100 μg/mL、高200 μg/mL 3 个质量浓度的血浆样品，涡旋混合1 min，按照上述血浆样品处理方法处理后，经高效液相方法分析测定各5次，峰面积代入标准曲线，以HSY A的测得量/加入量×100%计算回收率(%)。

得到平均回收率及RSD值的结果分别为(94.55 ±2.105 3)%、2.23%;(94.75 ±0.750 4)%、0.79%和(95.34 ±0.748 3)%、0.78%(n=5)。

1.2.8 方法学精密度的考察 取空白家兔血清3份，加入不同浓度的HSY A对照品溶液，分别配制成低50 μg/mL、中100 μg/mL、高200 μg/mL 3 个质量浓度的血浆样品，涡旋混合1 min，按照上述血浆样品处理方法处理后，对不同质量浓度同一样品溶液1日内各测定5次，5日内每日各测定1次，计算不同质量浓度的日内、日间精密度。结果日内精密度为 2.83%、0.80%、0.78%，日间精密度为2.06%、0.71%、0.90%(n=5)。

2 实验结果

2.1 血浆蛋白结合率的测定与计算 按照低(5 mg/kg)、中(10 mg/kg)、高(20 mg/kg)3 个剂量，分别吸取一定量的上述注射剂溶液(55.0 mg/mL)，3只家兔同时进行耳缘静脉注射给药，并于给药后15 min时间点进行耳缘静脉取血5 mL，置肝素化离心管中，20℃，离心15 min(3 000 r/min)，①取血浆0.5 mL，置冰箱冷冻保存，待测。②另取血浆0.5 mL，置超滤离心管中，4℃，离心15 min(7 500 r/min)［8］，取超滤液 100 μL，按 1.2.4 项下方法处理后，经高效液相方法分析测定，按以下公式计算药物的血浆蛋白结合率。

血浆蛋白结合率(%)=［1－(②药物质量浓度/①药物质量浓度)］×100%

2.2 数据与结果 羟基红花黄色素A低、中、高3个剂量水平的结合率分别为77.22%、78.31%、78.10%，见表 1。

表1 羟基红花黄色素A的血浆蛋白结合率

3 讨论

3.1 血浆蛋白结合的研究，包括结合机制、潜在的结合相互作用、血浆蛋白结合对膜转运的影响等研究内容，其中血浆蛋白结合率的测定为主要的基础研究。常用的方法有平衡透析法(equilibrium dialysis)、超滤法(ultra-filtration)、超速离心法(ultracentrifugation)、凝胶过滤法(gel filtration)等，本实验采用的方法是超滤离心法，实验操作简便，不耗时，同时采用固-液萃取法处理血浆样品，回收率高。

游离药物浓度存在于不含血浆蛋白的血清之中，有文献报告可用10 000 r/min分离血清去掉血浆蛋白，但通过试验效果不好，其并不能完全分离血浆，测定结果偏低，而采用超滤离心的方法效果令人满意，数据及结论可靠［7］。

3.2 本实验所选用的剂量是根据药物的临床成人每天用药推荐剂量按体表面积等效换算成家兔用药剂量，以其保证人用剂量在实验研究范围内，因而设定低、中、高三个剂量分别为5、10、20 mg/kg。其中中、高剂量高于临床人用剂量。

此外，取血时间设定为家兔耳缘静脉注射药物后15 min时，因为预实验表明此时药物在体内的分布可以完全达到平衡，此时测定的血浆蛋白结合率应该是比较准确的，可以视为初始状态，因此采样的时间定为15 min。

3.3 羟基红花黄色素A的血浆蛋白结合率较高，预示有一定的长效作用，并有一个相对较大的生物半衰期，药动学研究证实了这一点。因此，在临床给药方案设计时应注意给药的间隔时间。虽然动物的长期毒性试验表明连续用药并未发现药物的蓄积与毒性，但是在临床联合用药时，还是应该注意对羟基红花黄色素A血浆蛋白结合有竞争性抑制作用的药物的配伍使用。

［1］杨志福，梅其柄，蒋永培.红花有效成分及药理作用［J］.西北药学杂志，2001，16(3):131-133.

［2］李中原，涂秀华.红花黄色素的药理研究进展［J］.中药新药与临床药理，2005，16(2):153-156.

［3］梁 辉，范金英，李爱华，等.羟基红花黄色素A对大鼠局灶性脑缺血再灌注NMDAR1蛋白表达的影响［J］.中华老年心脑血管病杂志，2004，6(3):194-196.

［4］臧宝霞，金 鸣，司 南，等.羟基红花黄色素A对血小板活化因子的拮抗作用［J］.药学学报，2002，37(9):696-699.

［5］张海防，郭健新，黄罗生，等.羟基红花黄色素A在大鼠体内的药代动力学［J］.中国药科大学学报，2006，37(5):456-460.

［6］朴永哲，金 鸣.红花抗心肌缺血研究进展［J］.中草药，2001，32(5):473-474.

［7］李秋红，崔明宇，隋晓璠，等.丁香苦苷血浆蛋白结合率的测定［J］.哈尔滨商业大学学报:自然科学版，2008，24(2):148-150.

［8］姚志红，曹秀珍，邵 萌，等.超滤法测定甲基原薯蓣皂苷的血浆蛋白结合率［J］.中国中药杂志，2008，33(11):1291-1294.