羊肚菌发酵烟草多糖及其在卷烟中的初步应用

李 仙，董 伟，段继铭，彭国岗，王定伟

[1.云南瑞升烟草技术（集团）有限公司，昆明 650106；2.红塔烟草（集团）有限责任公司，云南 玉溪 653100]

羊肚菌( Morchella conica) 隶属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲（Discomycetes）、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)[1]。作为珍稀的大型真菌，羊肚菌含有大量的真菌多糖及菌物氨基酸，具有独特的风味，是世界上最著名的食药两用菌之一[2]。但是由于资源局限问题，很难在烟用香精香料中大规模使用。本研究从生物技术角度，分离出羊肚菌的菌丝体，利用菌丝体的延展性和羊肚菌代谢纤维素、木质素的生物学特性，首次将其在烟叶水提后的碎片上培养成功，将烟叶中的纤维素、木质素等不可提取的骨架基质转化为多糖等成分。并以发酵固嵺为香料提取的原料，采用真菌多糖的乙醇沉淀分离工艺获得具有含量较高真菌多糖的提取物[3]。并对羊肚菌发酵多糖进行了致香成分分析、热烈解分析及在卷烟中的应用研究。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种以云南野生黑脉羊肚菌子实体及菌柄等部位为原料采用大型真菌菌丝分离的试管法[4]，经3次传代后获得羊肚菌菌丝体，斜面形态见图 1。烟叶、烟碎片及烟末由车间提供。

仪器为高压蒸汽灭菌锅（上海华线医用核子仪器有限公司）、SKY-211B恒温摇床（上海素坤仪器有限公司）及生化试剂（北京奥博星生物技术有限公司）。

图1 野生羊肚菌斜面菌丝形态Fig.1 The mycelium of wild Morchella esculenta（L.）Pers.

1.2 方法

1.2.1 羊肚菌发酵原料的选择 羊肚菌是低温高湿嗜好的大型真菌，具有代谢木质素、纤维素的能力，选用富含纤维素、木质素的烟叶、烟叶碎片、烟末及其水提处理烟渣为原料进行试用固体培养基的配制（水:固料=3:2），121 ℃，灭菌30 min后接种羊肚菌菌丝进行发酵原料的筛选。

1.2.2 发酵用种子的培养 羊肚菌固体发酵用种子培养采用两种方式：液体摇瓶培养和固体菌棒培养。液体培养基采用文献[5]提供的培养基配方1（蔗糖2%、酵母膏0.5%、KH2PO40.05%、MgSO40.05%，pH 5.5）；实验室筛选的最适液体培养基配方2[玉米汁2%、酵母膏2% 、MgSO40.05%、KH2PO40.1%、(NH4)2SO40.5%，pH 7]及固体培养基（采用烟叶碎片水提渣，配制方法同 1.2.1），3种培养基进行种子培养5 d后接种烟叶碎片水提渣，7 d后进行发酵程度的对比。

1.2.3 羊肚菌发酵多糖样品的制备 以适合菌丝生长的烟叶碎片水提渣进行羊肚菌固体发酵实验。条件：接种量5%、温度22 ℃，湿度60%～70%，时间9 d。发酵后固嵺加入2倍水，采用多糖较适溶出温度90～95 ℃，回流提取2 h，提取2次，合并水提液。浓缩后采用4倍95%乙醇沉淀多糖类物质，离心得多糖成分，65 ℃干燥2 h，呈浅黄色固体粉末即为羊肚菌发酵多糖，溶解后呈棕红色。

1.2.4 羊肚菌发酵多糖中糖类的分析 羊肚菌发酵多糖中单糖及双糖测定采用高效液相色谱分析，分析条件：HPLC：waters 2690，检测器：waters 2410示差检测器，色谱柱：waters carbohydrate cartridge（4.6×250 mm cartridge）。检测结果表明，羊肚菌发酵多糖中不含葡萄糖、果糖、麦芽糖及蔗糖，其含糖类型为真菌多糖。

羊肚菌发酵多糖的测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖进行标准曲线制作[6]。准确称取羊肚菌发酵多糖0.095 g定容100 mL后稀释20倍，同标准曲线测定OD490 nm。

1.2.5 羊肚菌发酵多糖挥发性成分分析 取羊肚菌发酵多糖10.0 g同时蒸馏萃取后进行GC/MS分析，总离子流图见图2，分析结果采用面积归一法。化合物定性分析是根据GC-MS 联用所得质谱信息经计算机用Wiley、NISt 98 谱库与标准谱图对照、解析，确认其中的化学成分。

图2 羊肚菌发酵多糖致香成分总离子流图Fig.2 Total ion current of the polysaccharide extract

1.2.6 羊肚菌发酵多糖热裂解分析 称取4 mg羊肚菌烟草发酵多糖放入热裂解仪中，分别在 300、600、900 ℃时进行热裂解，裂解产物进入GC/MS进行分离和鉴定，应用Wiley、NISt 98 谱库进行检索。

1.2.7 羊肚菌发酵多糖的烟用效果评价 将羊肚菌发酵多糖添加至 1#、2#云南某品牌卷烟加料丝中，添加量0.002%，置于22 ℃和RH60%恒温恒湿箱平衡水分24 h后卷制成卷烟进行评吸。

2 结 果

2.1 羊肚菌发酵烟叶原料的选择

以烟叶、烟碎片、烟末及相应水提后烟渣为主要筛选对象，经过羊肚菌固体渥堆发酵后结果如表1。结果表明，由于烟叶本身具有部分烟碱抑制了羊肚菌菌丝的生长，未提取的3种形式的烟叶原料均不适合羊肚菌发酵，而水提后的原料以烟叶碎片为最佳，发酵原料碎片间有合适的间隙，具有较好的通气性，利于菌丝蔓延。

2.2 种子发酵方法的选择

采用两种液体发酵培养基和一种固体发酵培养基进行接种对比后结果如表 2，结果表明，固体菌棒培养的种子具有接种点多，生长速度较快的优点，可以作为固体发酵接种的种子来源。

表1 羊肚菌发酵原料筛选结果Table1 Screening results of tobacco matrix suitable for the growth of Morchella esculenta（L.）Pers.

表2 羊肚菌发酵用种子筛选结果Table2 Screening results of vaccination methods

2.3 真菌多糖含量的测定

通过苯酚-硫酸法测定以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=0.0127x-0.0073（R2=0.9939），如图 3。

图3 葡萄糖标准曲线Fig.3 Glucose standard curve

实验结果表明，在浓度为 5.52～23.92 μg/mL范围内吸光值与多糖含量呈良好的线性关系。按要求将样品稀释至测定范围，结果表明，发酵烟草多糖0.095 g定容100 mL后稀释20倍，同上标准曲线的测定，吸光度为 OD490 nm=0.281，计算真菌多糖含糖量为42.6%。

2.4 羊肚菌发酵多糖挥发性成分分析

羊肚菌发酵多糖主要成分是真菌多糖类物质，略有羊肚菌的天然菌香，GC/MS技术分析后共鉴定出匹配度在80以上的化合物13个，检测结果显示主要为长链碳酸及其酯类。检测总离子流图见图2，结果见表3。

2.5 羊肚菌发酵多糖热裂解分析

羊肚菌发酵多糖热裂解分析结果见表4。结果表明，羊肚菌发酵多糖在300 ℃热裂解产物较少，均为酮类及醛类物质，在600 ℃及900 ℃热裂解产物较多，主要产物除糠醛类物质外，还有多种呋喃类和醛酮类成分，这与羊肚菌发酵多糖中高含量的真菌多糖类物质相吻合，裂解主要成分具有甜香、烟草香等香味特征，理论上具有改善卷烟的吸味、丰满烟香等功能。

表3 羊肚菌发酵多糖主要香气成分分析Table3 The compositional analysis results of the polysaccharide extract

2.6 羊肚菌发酵多糖在卷烟中的应用效果评价

羊肚菌发酵多糖添加至1#、2#云南某品牌卷烟加料丝中，评价结果见表 5。结果表明，羊肚菌发酵多糖在醇和烟香，提高舒适性，去除杂气等方面具有明显效果。

3 结 论

3.1 羊肚菌在烟叶基质上的生长特性

野生羊肚菌分离得到的菌丝对烟草中的烟碱呈现不耐受的特点，通过本研究表明，羊肚菌对烟叶基质要求分散度较好，具有合适的溶氧空隙。通过水提后的烟叶碎片在羊肚菌的适宜生长条件下（温度22℃，湿度60%～70%），能够获得较大的生长量，且蔓延度好，菌丝保持较高的白度，可以作为羊肚菌固体渥堆发酵的基质使用。

3.2 羊肚菌发酵多糖成分的研究

羊肚菌多糖（MEP）有别于烟草多糖成分如纤维素、半纤维素、果胶等成分，相反羊肚菌可以以该类分为底物生成由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖等残基为重复单元组成的杂多糖[7]，根据真菌多糖不溶于乙醇的特点，对真菌多糖进行粗提，其中真菌多糖含量达到42.6%，香气分析表明，致香成分含量较少，仅检测出 13种，大部分为长链碳酸及其酯类，但通过热裂解表明，羊肚菌发酵多糖可在抽吸时形成糠醛类物质外，还有多种呋喃类和醛酮类香气成分，对丰富烟香、改善吸味具有较好效果。

表4 羊肚菌发酵多糖热裂解成分分析Table4 The pyrolysis results of the polysaccharide extract

表5 羊肚菌发酵多糖在卷烟中的试用效果Table5 The evaluation of cased cigarettes and flue-cured tobacco of the polysaccharide extract

3.3 羊肚菌发酵多糖的应用效果

羊肚菌发酵多糖在卷烟中的试用结果表明，其在醇和烟香、提高舒适性、去除杂气等方面具有较好的作用，且用量远远低于普通香精香料的用量，可适用于卷烟加料及烟叶醇化。

[1]兰进，曹文苓，徐锦堂.中国羊肚菌属真菌资源[J].资源科学，1999，21（2）：56-61.

[2]Duncan C J, Pugh N, Pasco D S, et a1.Isolation of a galactomannan that enhances macrophage activation from the edible fungus Morchella esculenta[J].J Agric Food Chem, 2002, 50(20): 5683-5685.

[3]许周善，周晓燕.冬虫夏草多糖的研究进展[J].工业微生物，2000，30（1）：56-57.

[4]李林辉.野外分离大型真菌菌种技术[J].中国食用菌，2002，21（5）：11-12.

[5]武秋立，安家彦.羊肚菌的液体深层培养[J].食品与发酵工业，2004，30（2）：72-76.

[6]谭晓虹，王治宝，李如章.北五味子中多糖含量的测定[J].河北北方学院学报：医学版， 2005，22（6）：45-46.

[7]魏芸，张天佑.羊肚菌多糖的分离纯化及组成结构分析[J].植物资源与环境学报，2000，9（2）：14-17.