甲基磺酸乙酯对烤烟种子发芽率的处理效应

王军伟，蒋彩虹，宋志美，张 丽，王 鲁，王元英，刘贯山*

（1.中国农业科学院烟草研究所，农业部烟草类作物质量控制重点开放实验室，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

诱变育种是人为利用物理或化学因素来处理种子、植株、组织、细胞或花粉使其基因型产生遗传变异，从中选择培育新品种的方法[1]。物理诱变应用较多的是辐射诱变，即用 γ射线、β射线、χ射线、中子等物理因素诱发变异。其诱因是高能射线造成基因突变、染色体结构变异。化学诱变是用化学诱变剂如甲基磺酸乙酯（Ethyl Methane Sulfonate, EMS）、硫酸二乙酯等烷化剂或碱基类似物等处理植物材料，以诱发遗传物质的突变，从而引起形态特征的变异，然后根据育种目标，对这些变异进行鉴定、培育和选择，最终育成新品种。EMS由于其操作简便，成本较低，诱变效果具有一定专一性和破坏性较小，诱变频率高，突变性状多为显性基因控制，易于筛选[2]，染色体畸变相对较少[3]等优点，被有效用于各种作物的诱发突变育种，已育成的水稻、小麦、大麦和大豆[4]等突变体达2250个[5]。目前，关于EMS处理烟草的诱变育种研究报道还不多，陈廷俊等[6]利用0.3% EMS处理烟草Burley18的花培单倍体幼苗心叶，并接种 CMV，结合绿岛组织培养技术，筛选出抗CMV的细胞突变系R2和R3。Medrano H等[7]研究发现，经0.1%浓度处理1 h和0.05%浓度处理1～2 h的烟草花药，对提高花粉脱分化小植株的数量最有效。

本试验以EMS作为诱变剂，通过探讨EMS对烟草种子发芽率、根长等性状的诱变效应，以期为开展烟草种子化学诱变研究，构建烟草突变体库奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为烤烟主要品种：中烟 100、红花大金元、K326、云烟 97、云烟 87。种子由中国农业科学院烟草研究所种质资源库提供。EMS诱变剂购自SIGMA公司，规格为5G。

1.2 处理浓度与方法

处理浓度分别为0（CK）、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%和1.3%。处理方法是将pH 6.5的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（Na2HPO4·12H2ONaH2PO4·H2O）[8]作为溶剂，配制浓度为 0（CK）、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%和1.3%的EMS溶液（V/V）。称取供试种子各1 g，用纯水浸种4 h。用滤纸吸干种子表面的水后，将种子分别加到装有500 μL上述浓度EMS溶液的EP管中，放置于26 ℃、110 rpm的摇床内，诱变处理16 h。诱变处理后，用pH 6.5的0.01 mol/L磷酸缓冲液润洗，每隔0.5 h换一次磷酸缓冲液，洗3次后用长流自来水冲洗2 h左右。然后将种子点播于铺有滤纸的培养皿中，每个处理重复4次，在26 ℃培养箱中培养。第14天调查发芽率[9]，第30天统计根长。发芽率/%=（14 d发芽种子数/供试种子数）×100%；相对发芽率指处理的发芽率/对照的发芽率。相对根长指处理的根长/对照的根长。在不同浓度EMS处理烤烟种子后，以相对发芽率为0.5时的EMS处理浓度即半致死浓度（Lethal concentration 50, LC50）为标准，探究EMS的适宜处理浓度。

1.3 数据分析

对试验中的种子发芽率和种苗根长进行调查，结果用 SPSS 11.5[10]及 SAS 9.1[11]数据软件进行分析。

2 结 果

2.1 EMS对烤烟发芽率的影响

半致死浓度（LC50）指处理后种子或植物的某一器官成活率为对照50%的处理浓度。一般以半致死浓度为基准，通过增加或降低试验剂量以选择适宜处理浓度[12]。由表1和图1可以看出，与CK相比，全部 EMS处理对烟草种子的发芽率均有较大影响。不同品种对 EMS的敏感性不同，但总趋势都是随着EMS浓度的升高，相对发芽率直线下降。在0.1%～0.5%浓度区间内随EMS处理浓度的升高，发芽率下降的幅度较小，而在0.7%～1.3%浓度区间内随 EMS处理浓度的升高，发芽率下降的幅度较大。5个品种的下降幅度不同，K326下降幅度最小，中烟100、红花大金元、云烟87次之，云烟97下降幅度最大。当EMS浓度达1.3%时，发芽率全部为0，说明5个烤烟品种的致死浓度均为1.3%。

差异显著性分析表明，同一烤烟品种不同EMS浓度的发芽率间差异显著，不同烤烟品种同一EMS浓度的发芽率间也有显著差异（CK和1.3%EMS浓度除外），而且前者的差异程度大于后者，这说明EMS浓度是造成供试种子发芽率变化的主要因素，但存在有基因型差异。

表1 不同品种经EMS处理后烤烟的发芽率 %Table1 Germination rate of different flue-cured tobacco varieties treated by various EMS concentrations

图1 不同浓度EMS处理后供试品种的相对发芽率Fig.1 Relative germination rate of various cultivars treated by different EMS concentrations

通过逐步回归分析，获得了5个烤烟品种发芽率随EMS浓度变化的回归方程（表2）。可以看出，发芽率与 EMS浓度呈显著负相关。由回归方程可以计算出，中烟100、K326、红花大金元、云烟87和云烟 97的 EMS LC50分别为 0.49%、0.52%、0.43%、0.35%和0.35%。从图1中也可以直观地看出，云烟87和云烟97的EMS LC50是一致的，但比中烟100、K326和红花大金元的低，其中K326的最高。由此可以认为，供试烤烟品种对 EMS的敏感性由大到小依次为云烟 87=云烟 97＞红花大金元＞中烟 100＞K326。

表2 5个烤烟品种的发芽率和EMS浓度的回归方程Table2 Regression equations between germination rate and EMS concentrations for five flue-cured tobacco varieties

2.2 EMS对烤烟种苗根长的影响

由表3和图2看出，浓度为0.1%的EMS对各品种种苗根长均有促进作用。中烟100、K326、红花大金元、云烟97、云烟87的种苗根长分别比CK增长了6.77%、4.74%、5.37%、2.52%、1.18%。随着 EMS浓度进一步提高，根长受到抑制，且损伤程度随着 EMS浓度的逐步增加而加大。其中随EMS浓度增大，K326的根长与CK相比减短最小，中烟100、红花大金元、云烟87次之，云烟97减短最大。

表3 不同浓度EMS处理后供试品种种苗根长 cmTable3 Root lengths of various cultivars treated by different EMS concentrations

图2 不同浓度EMS处理后5个烤烟品种的种苗相对根长Fig.2 Relative root lengths of five flue-cured tobacco varieties treated by different EMS concentrations

虽然同一品种不同 EMS浓度的种苗根长之间以及不同品种同一 EMS浓度（CK、1.1%和1.3%EMS浓度除外）的种苗根长之间均达到显著差异，但根长的差异程度要小于发芽率。通过逐步回归分析，也获得了5个烤烟品种根长随EMS浓度变化的回归方程，种苗的根长与 EMS浓度呈显著负相关（表4）。

表4 5个烤烟品种的种苗根长和EMS浓度的回归方程Table4 Regression equations between root length and EMS concentrations for 5 flue-cured tobacco varieties

3 讨 论

目前，烟草诱变育种多采用γ射线[13]、离子注入[14]等物理方法，关于烟草化学诱变特别是 EMS诱变处理的报道较少。本试验选取5个烤烟栽培品种中烟 100、红花大金元、K326、云烟 97、云烟87进行不同 EMS浓度处理。结果表明，在0.1%～1.3%处理的浓度范围内，EMS对种子的发芽率主要呈抑制作用。以半致死浓度为选择标准，确定了 EMS诱变烤烟不同品种的适宜浓度为0.35%～0.52%，致死浓度均为 1.3%。它们对 EMS的诱变敏感性顺序为云烟 87=云烟 97＞红花大金元＞中烟 100＞K326。Julio E 等[15]采用白肋烟（BB16NN）为材料，以种子处理后7 d的发芽势降低25%～40%为筛选条件，选择的EMS适宜处理浓度为0.6%和0.8%。史跃伟等[16]以烤烟（K346、NC82和云烟 85）为材料，得出 EMS适宜的诱变浓度为0.35%，且3个品种对EMS的诱变敏感性顺序为云烟85＞K346≈NC82。本试验得到的烤烟适宜EMS诱变浓度比拟南芥的适应浓度0.2%[17]要高，与大豆的适应浓度 0.4%[18]接近，比小麦的适应浓度0.9%或1.0%[19]和水稻的适应浓度1.5%[20]的要低的多，与史跃伟等[16]得到的烤烟 EMS诱变适宜浓度0.35%接近，但比其稍高。因此，在对植物种子进行处理时，不同种植物之间，同种植物不同类型（例如烤烟和白肋烟）之间以及同种类型（例如烤烟）不同品种之间 EMS诱变的适宜浓度以及对EMS的敏感性均存在显著差异。

通过差异显著性分析发现，同一烤烟品种不同EMS浓度的发芽率间差异显著，说明EMS浓度是影响烤烟种子发芽率的主要因素；而不同烤烟品种同一 EMS浓度烤烟种子的发芽率也有显著差异（CK和1.3%EMS浓度除外），可见品种也是影响EMS处理种子发芽率的关键因素。但是前者的差异程度大于后者，因而在进行 EMS诱变处理时，针对不同的烟草品种类型要分别摸索其适宜的 EMS浓度。

试验表明，低浓度处理对种子发芽率和种子根的伸长有促进作用，高浓度处理对种子发芽率和种子根的伸长均呈显著抑制作用。原因可能是低浓度的 EMS能促进细胞的呼吸作用，生理代谢增强，从而促进其生长分化；而高浓度的 EMS则对烟草的生理代谢有抑制作用，且浓度越高代谢受到的抑制作用越强。

烤烟 EMS诱变适宜浓度的获得为创建烟草突变体库奠定了基础，后续研究也得到了许多不同表型的突变体。这些突变材料可用于克隆和阐明烟草的重要功能基因，是烟草功能基因组学研究中不可缺少的重要组成部分[21]。还可直接育成烟草新品种或创造新的烟草种质资源，极大丰富烟草的遗传资源。

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