利用ISSR分析贵州部分烟草品种（系）的遗传关系

胡重怡，蔡刘体

（贵州省烟草科学研究所，贵阳 550018）

贵州是种烟历史悠久的主产烟区，在长期的种植过程中，选育出了不少优良地方品种（系），作为一笔宝贵的烟草种质资源，弄清这些地方品种（系）之间的亲缘关系，对分析贵州烟草品种布局、地方品种资源归类及今后育种亲本的选择都有一定的指导意义。近年来，分子生物学迅猛发展，不断涌现出适用于种群遗传分析的DNA分子标记技术。其中Zietkiewicz等[1]人于1994年发展的一种基于微卫星系列的分子标记技术简单重复序列区间ISSR（inter simple sequence repeat），其基本原理是根据植物广泛存在SSR(simple sequence repeat)本身设计引物，同时在SSR的5’或者3’端添加2～4个非重复随机选择的锚定碱基，以引起特定序列位点的扩增，提高了PCR扩增反应的专一性[2]。由于SSR在真核生物中的分布非常普遍，并且进化变异速度非常快，因此 ISSR引物可以检测基因组位点的更多差异[3]。ISSR具有简便、无需预先知道序列信息、重复性强、通用性好等特点，在植物的物种鉴定[4-5]、系统进化[6-7]及遗传图谱构建[8]等方面得到广泛应用，其在水稻、小麦、玉米、油菜、青麻、烟草等作物上已成功应用[9-14]。本研究利用ISSR分子标记手段来分析品种（系）间的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 材料

试验中的供试品种（系）见表1。

表1 供试烟草品种（系）名称及来源Table1 Origins of tobacco materials used in the study

1.2 烟草叶片DNA提取

各材料用DNeasy® Plant Mini Kit（QIAGEN）试剂盒，按照操作说明提取烟草DNA。

1.3 ISSR扩增

参照哥伦比亚大学（UBC）公布的100条通用引物，引物由上海生工合成。从中筛选出23条扩增条带较多，重复性好的引物对所有个体进行扩增，扩增反应在eppendorf公司的Mastercycler gradient PCR仪进行，反应体系为20 μL PCR反应总体积，20μL中，1×Taq 酶配套缓冲液，0.5U Taq 聚合酶，0.5 μmol/L引物，0.125 mmol /L dNTPs，1.5 mmol/L MgCl2，1 ng/μL模板DNA。扩增条件经优化后确定为：95℃ 5 min；94℃ 30 sec，52 ℃ 30 sec，72 ℃ 40 sec，30个循环；72℃ 7 min。

PCR产物在8%的聚丙烯胺凝胶垂直电泳中进行电泳分离，在25℃，120V恒压下电泳2.0 h，用银染法显影[15]。

1.4 ISSR分析

ISSR扩增产物以0、1、9统计建立数据库，相同迁移位置的有带记为1，无带记为0，扩增失败或者缺失的记为9。遗传相似系数按公式GS＝2Nij/(Ni＋Nj）计算，其中Nij表示基因型间共有带数目，Ni和Nj表示两基因型各自的条带数目，遗传距离GD＝1－GS计算，使用用SimQual统计17份烟草资源之间的遗传相似系数，按照UPGMA的方法画出聚类树状图。

2 结 果

2.1 烟草DNA的提取与检测

DNA琼脂糖电泳检测结果见图1，本文电泳排列顺序均从左至右依次为：DL2000 Marker、遵烟6号、TD3、金烟1号、草海1号、娄山1号、毕纳1号、兴烟1号、QN-1、ZYMT-1、CZ-1、TZ-1、黔西1号、NC82、红花大金元、K326、云烟85、贵烟11，从图1可以看出实验样品DNA提取完好，无RNA、蛋白污染，无拖尾现象，可以用作DNA分子标记筛选等分析实验。

2.2 地方性烟草品种（系）的ISSR多态性

23条ISSR引物，均能扩增出来7～22条带，其中有9条引物在17个地方品种中扩增出多态，图2、图3分别为引物UBC810、UBC836扩增出的图谱。9条引物共扩增出了173个位点，其中多态位点51个，多态比例为29.48%。

由图2可以看出，利用UBC810引物，每个品种（系）都有各自的指纹图谱，可以把不同的品种（系）区分开。即使是亲缘关系很近的品种，如K326和云烟85之间，也可以根据各自特异条带区分开来（图2、图3）。

利用NTSYS2.0软件对多态条带进行统计，用SimQual计算遗传相似系数（GS）结果见表2，并用SAHN根据UPGMA进行聚类分析，构建聚类图如图4。从聚类图（图4）可以看出，除遵烟6号、娄山1号和TD33个品种（系）外，其余14个品种（系）大致可以分为3个组群，红花大金元组群包含7个品种（系），NC82组群包括4个品种（系），K326组群包括3个品种（系）。表2显示，贵烟11和草海1号的遗传相似系数最远，为0.2127；金烟1号和QN-1、CZ-1两者的遗传相似系数最近，为0.7872。

3 讨 论

图1 17个烟草品种（系）DNA电泳图Fig.1 Electrophoresis pattern of 17 tobacco samples total DNA

图2 UBC810 引物扩增结果Fig.2 ISSR bands of tobacco amplified by UBC810

图3 UBC836 引物扩增结果 Fig.3 ISSR bands of tobacco amplified by UBC836

表2 17个烟草品种之间遗传相似性分析Table2 Genetic similarity of 17 tobacco samples based on ISSR analysis

本研究首次对贵州地方性品种之间的亲缘关系做出了初步探索，23条ISSR引物对17个品种（系）进行分析，有9条引物扩增出了多态位点，多态比例为29.48%。且利用这9条引物，每个品种（系）都有各自的指纹图谱，可以把不同的品种（系）区分开。这说明ISSR分子标记技术可以用来作为指纹图谱和品种鉴定手段来利用，借以弥补烟草分子标记手段缺乏的不足。

由聚类图（图4）可以看出，贵州地方品种（系）大致可以分为3个组群，分别为红花大金元组群、NC82组群和K326组群。贵州在长期烟草种植过程中，红花大金元、NC82、K326作为主栽品种一直充当着重要的角色，在长期的驯化过程中，经由自然突变、系选、杂交等手段又涌现了许多体现贵州特色的本地品种（系），这些品种（系）大多比较适应贵州的特有气候环境，为丰富贵州特色品种、创造新种质起了一定的作用。

图4 17个烟草品种的聚类分析Fig.4 Genetic relationship of 17 tobacco samples generated from ISSR data

由聚类图（图 4）可以看出，贵州地方特色品种（系）与常规品种之间的亲缘关系较近，地方品种（系）在DNA水平上的多态性，远没有其在表现型上的多态性丰富。长期以来，我国烟草育种的常用亲本主要集中在Hicks和Coker139系列及其衍生的几个品种资源里，导致现在种植品种（系）遗传背景狭窄。此外，由于烟草是自花授粉作物，本身变异较少，基因型相似性比较高，这可能是烤烟种质遗传多样性较低的主要原因。由此可见在今后的育种过程中，应该多考虑亲本之间的遗传距离，通过选择遗传距离远的亲本杂交来扩宽烟草种质遗传基础，丰富烟草基因型种类，引入外源基因。

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