烟草基因组学研究方法篇：3.烟草功能基因组学中的功能缺失与功能获得策略

李凤霞

（中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

功能基因组学研究中，常常通过改变基因的表达水平，然后观察其生物学性状、环境适应性以及生理或代谢途径等方面的变化来研究基因相应的生物学功能。这种研究策略包括强制性地沉默或升高特定基因的表达水平，即功能缺失（loss of function）和功能获得（gain of function）策略。

1 功能缺失策略

基因功能缺失策略即筛选目的基因功能部分或全部丧失的植株，比较其与野生型植株在表型、生理代谢和基因表达上的差异，分析该基因的功能。以往功能缺失研究通常是通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的植株，但概率很低，现在一般通过反义RNA（antisense RNA）、共抑制（cosuppression）、人工诱变、RNA干扰（RNA interference, RNAi）来进行基因功能缺失研究。

1.1 反义RNA

反义RNA是指与特定DNA或RNA具有互补序列的小分子RNA，它们通过特异性的碱基互补方式抑制或封闭相应基因的表达。反义RNA技术提供了直接有效地人为控制基因表达的方法，现已成为功能缺失研究中的一项重要技术[1]，并在烟草功能缺失研究中得到较多的应用[2-3]。由于该方法的抑制效率不能达到理想的功能缺失，因而无法对基因功能进行大规模的准确分析，使得其应用受到一定的限制。

1.2 共抑制

共抑制是指正向的基因全长序列与高活性的组成型启动子或组织特异性启动子融合，进行遗传转化，转基因植株中该序列所表达的RNA抑制了相应内源基因的表达。共抑制现象来源于一些植物转基因事件偶然发现，最著名的是Napoli等[4]的矮牵牛花色改良实验，将花色有关的查尔酮合成酶基因（CHS）在矮牵牛中过表达后，约50%转基因植株的外源CHS与内源基因一起发生沉默，导致花色改变。Matzke等[5]将Hyg OCS转化经过KanNOS基因遗传转化的烟草中，发现了转基因的基因失活现象。Goring等[6]进行了相似的实验，将nopaline合成酶基因的部分编码序列转化到已经转化了nopaline合成酶基因并能表达的转基因烟草中，该基因的mRNA降到了最低点。

1.3 人工诱变方法

人工诱变获得突变体是功能缺失研究中不可缺少的一种方法，突变能导致基因功能的丧失或减弱。其中在T-DNA插入突变研究中，根据目标基因序列和插入序列设计的特异引物对这些突变体基因组DNA进行PCR扩增，可以筛选到任何一个插入失活的基因。目前在烟草上通过人工诱变的方式获得了抗烟草花叶病、不育、温度依赖、低烟碱、白化等突变体，并鉴定了部分导致功能缺失的突变基因[7]。由于烟草是异源四倍体植物，烟草中有有一定数量的基因是多拷贝的，甚至紧密地串联在一起，在利用人工诱变方法分析基因功能时，通常不易得到目标基因的纯合突变体。

1.4 RNAi

RNAi是指双链RNA分子引起的序列特异性降解靶基因mRNA，从而导致内源靶基因沉默的现象。与反义RNA和共抑制技术相比，RNAi能够强有力地抑制序列特异的目的基因表达，抑制效率高，操作简便、迅速，耗费的精力和财力较小。现在，RNAi技术已经成为基因功能缺失研究的常规手段，并成为当前植物生物学家探索基因功能的一个有力的工具[8]，在烟草基因缺失研究中也具有良好的应用前景[9]，中国农业科学院烟草研究所通过GATEWAY方法构建烟草抗病基因同源序列的RNAi文库，通量遗传转化后进行相应基因的功能鉴定。

2 功能获得策略

新基因的功能获得策略是指通过将新基因直接导入到细胞或生物体中，通过观察其细胞生物特性或特体表型遗传性状的变化来鉴定基因的功能，常用的方法有超表达（overexpression）、基因诱导表达（inducible gene expression）和获得性突变。

2.1 超表达

超表达是指目的基因全长序列与高活性的组成型启动子或组织特异性启动子融合，通过转化，获得该基因产物大量积累的植株。该方法已成功鉴定了一批烟草编码基因、转录因子的功能[10-11]，但与反义抑制和共抑制类似，它也有转基因植株的致死效应或强烈的多重效应，从表型中鉴定出所需的转基因植株较为困难。

2.2 基因诱导表达

在转基因的突变体、异源受体植株或组织中，通过在携带外源基因的载体上加上组织特异性启动子或诱导表达启动子，控制外源基因在特定的时间或特定的组织器官中表达，可避免超表达所带来的麻烦。在非诱导条件下，转基因不表达或表达但其产物没有活性，不会干扰植物的正常发育，也不会导致多重效应。一旦给予诱导，基因将迅速表达或其产物迅速被激活，并在一定时间内保持稳定。利用诱导表达系统，烟草糖基转移酶基因被诱导表达，从表型变化鉴定了其功能[12]。

2.3 获得性突变

功能获得性突变方法是从本质上改变基因作用的一种突变，该方法能使在植物特定组织、细胞中原来不表达的基因得以表达，或表达较弱的基因表达水平升高，使表型更加明显。常用的功能获得性突变策略是对T-DNA进行人工修饰，在T-DNA上加入调控序列，如35S强启动子或其他特异性表达启动子，插入的T-DNA可能导致插入位点邻近基因的过量表达或表达的时空特异性改变，从而有效的鉴定基因功能。

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