不规则抗体筛选方法的比较

李炜华

(江苏省宿迁市中心血站,江苏 宿迁 223800 E-mail:sqltdr@126.com)

不规则抗体是指除ABO血型系统以外的所有抗体。对受血者的血浆做常规的抗体筛选试验以发现有临床意义的不规则抗体,从而避免输血的不良反应,保证临床用血的安全,特别是对有输血史和妊娠史的择期手术患者有更为重要的临床意义。抗体检测还可以协助临床诊断自身溶血性贫血、新生儿溶血病及溶血性输血反应。由于筛选方法较多,灵敏度、准确性和重复性均有所不同,故各实验室采用的方法不同。笔者对2009年12月1日～2010年11月30日期间各医院送至本站的需输血患者的血浆进行抗体筛选,并对阳性的标本分别用盐水法、凝聚胺法、抗人球蛋白法、微柱凝胶免疫检测法进行了检测,并对结果、灵敏度、所用时间及所用血浆量进行了比较与分析,现报告如下:

1 材料与方法

1.1 材料 筛选红细胞由上海输血技术有限公司提供;凝聚胺由BASO公司提供;抗人球蛋白试剂由上海血液生物医药有限责任公司提供;微柱凝胶免疫检测卡由长春博迅生物制品有限公司提供;免疫微柱孵育器及血型血清学多用离心机均由长春博研科研仪器有限公司提供。

1.2 标本 2009年 12月 1日～2010年11月30日各医院送至本站的需输血患者的血浆,共计3 020份。

1.3 方法

1.3.1 盐水法 在标记好的试管中加入2滴待检血浆,再加入1滴筛选红细胞,3 000r/min离心15s后,轻轻摇动观察有无凝集,肉眼无法确认的,用显微镜观察。

1.3.2 凝聚胺法 在标记好的试管中,分别加入筛选红细胞各1滴,待检血浆 2滴,然后加入 LIM液4滴,Polybrene液2滴,3 500r/min离心10s,倾去上清。轻轻摇管,判断有无凝集。若无凝集,则应重做试验。再加入重悬液2滴,轻轻摇动试管,观察凝集并判读结果。若凝集消散,表明待检血浆中不含有与已知红细胞上抗原相对应的抗体;反之,则表明待检血浆中含有与已知红细胞上抗原相对应的抗体。

1.3.3 抗人球蛋白法 在标记好的试管中加血浆2滴,再加1滴筛选红细胞,37℃孵育30min,用足量生理盐水洗涤3～4次,所用盐水量不得少于试管容量的3/4,加盐水前要把细胞充分摇散,加盐水时要有冲力,能充分混匀。每次倾倒盐水要沥干,管口要吸干,加抗人球试剂1～2滴,立即离心读取结果。如为阴性需加入已致敏的阳性红细胞,离心看结果,结果应为阳性,此阴性为真实结果,同时还需做阴、阳性对照。

1.3.4 微柱凝胶免疫检测法 将微柱凝胶试剂卡的微管做好标记,分别加入筛选红细胞悬液50μ l于管中,再加入待检血浆50μ l,同时加入阴、阳性对照血浆各50μ l。阴性对照血浆取自健康成年男性AB型血浆。加样后置孵育器中孵育15min,然后使用血型血清学多用离心机离心,900r/min 2min,1 500r/min 3min,肉眼观察结果。结果判定参照使用手册。

2 结果

2.1 四种方法检测结果的比较 检测的3 020余份标本中共检出11例不规则抗体,检出率为0.37%。用凝聚胺法测得的阳性标本再用其它几种方法所测结果的比较见表1。抗体特异性的鉴定使用谱细胞。

表1 11份标本抗体检出方法的比较

表2 四种方法出现凝集时最高稀释度

2.3 四种方法所用血清量和实验时间的比较 见表3。

表3 四种方法所用血清量和实验时间的比较

3 讨论

四种方法检测结果比较显示,盐水法只能检测出室温或低于室温条件下出现反应的IgM类型的抗体,如抗M、冷抗体等。冷抗体只在4℃有意义,故临床意义不大,而大多数的有临床意义的不规则抗体(如 Rh系统的抗体),多为IgG型抗体,又称为不完全抗体,不能在盐水介质中出现肉眼可见的凝集反应,所以盐水法筛选抗体已逐渐被淘汰,只要条件允许应做其它敏感试验。

除盐水法外,其它3种方法均能检测出IgG型抗体,阳性符合率均为100%。多种促进IgG抗体快速凝集的方法中,以凝聚胺为优选,其方法快速,操作简单,可引起正常红细胞的可逆性凝集,如果被抗体致敏的红细胞与Polybrene连在一起,就会发生不可逆性凝集,加入重悬液后,抗体介导的特异性凝集将继续存在,而非特异性凝集的细胞将散开[1]。抗人球蛋白法是最为经典的检测不规则抗体的方法,理论明确清晰,结果确定,可用于确定性试验,绝大多数有临床意义的抗体在孵育时均可以结合红细胞上的相应抗原,但不能引起凝集反应,加入抗球蛋白试剂后能检出和证实这种抗体,它是确定临床不规则抗体最可靠的方法。微柱凝胶免疫法是红细胞膜抗原与相应抗体在凝胶介质中发生的凝集反应,是一种免疫学检测新技术,在一些先进国家,已成为常规血型血清学检测新技术[2]。在国内,微柱凝胶试验已逐渐进入实验室,应用于血型鉴定、交叉配血、抗体鉴定等试验中,受到工作人员的肯定和好评[3,4]。它保持了传统的抗球蛋白试验准确可靠的特点,克服了其繁琐费时的洗涤过程。不必洗涤红细胞,不用担心抗球蛋白抗体被中和而出现假阴性报告,不仅节约了时间而且也不需要很高的操作技术,最重要是减少了洗涤而导致技术上的错误。操作方便、标准,结果清晰可靠,重复性好,一卡 6管,减少标记,避免错误,所需标本量少,可拍照存档,存入计算机中作为实验室资料存档。其灵敏度高,不用显微镜,不用反复重做,有利于推广,是抗人球蛋白法很好的替代方法,它等同于甚至好于抗人球蛋白法,这也在其他人的研究中得到证实[5,6]。此法还能用于血型鉴定、交叉配血、骨髓细胞分型等项目[4]。

凝聚胺结果不好判断,要有丰富的实际操作经验。凝聚胺是促凝剂,会造成细胞的假凝集,误判为弱阳性。出现弱阳性的标本还要做抗人球蛋白法,以此结果为准。操作中也不能剧烈晃动,会使弱凝集消失,误判为阴性。抗人球蛋白法操作复杂,时间长,大规模检测时受到限制。洗涤是抗人球蛋门试验的关键步骤,不容易掌握。各种对照试验都正确,抗球蛋白试验才能确认。由于试验需要非常繁琐的洗涤过程,需要时间长,凝集强度的判定不是很清楚,操作人员的主观因素比较大,操作者对反应终点与结果判断需要有一定经验,对同一标本不同操作者的结果可能不同,因此不是临床抗体大规模筛选时的常规方法[2]。特别是1W和(+),只有在显微镜下较清楚,振荡试管过度用力也会将弱凝集摇散而判为阴性,且所有结果不能拍照存档。微柱凝胶免疫法,需要专用的孵育器和离心机,可在有条件的血液中心和血站推广。当红细胞浓度＞5%或＜3%时,红细胞被抗体严重包被,或血清蛋白异常时,微柱凝胶免疫法可能出现假阳性或假阴性,这是操作者应当注意的问题。

从价格方面考虑,盐水法最便宜但不能检测出IgG型抗体。凝聚胺法价格合适,一般实验室都可以接受。相比较而言,抗人球蛋白法价格低廉而微柱凝胶免疫法需配备专用的离心机及孵育器,价格昂贵。

从所用时间上看,盐水法、凝聚胺法时间较短,抗人球蛋白法所用时间较长,微柱凝胶免疫法适中。从所用量上看,微柱凝胶免疫法所用血清量是其它方法的1/3～1/2,其它方法所用标本量相近。

综上所述,各种血型血清学试验都有其自身的特点,适用不同范围及不同情况,故临床血型工作者应熟练掌握这些技术。选择足够的敏感技术检测出受检者血清中非常有意义的抗体,在临床输血中有着极为重要的意义。即使受检者血清中抗体对输入的不相容红细胞抗原呈弱反应,也能够发生快速强的回忆反应,增加抗体产生,破坏红细胞,对病人造成难以估量的后果。因此每次试验结果要立即记录并和病人病历记录对照,确信与前次结果一致,否则提示可能有错,还应从病历中查看是否有过临床有意义的红细胞抗体,是否有过血型检测的困难,是否曾有过输血及输血反应的记录以及妊娠史等,以确保输血的安全。已知病人血清中有抗体时,一定要检测确认准备输入的红细胞的血液成分有无相应的抗原,并输注与之相配合的血液。

没有一种最理想的单一方法适用于所有标本且能检出所有抗体,因为人群中大约1%的未经选择的血清可能含有某些低频率抗原,即使进行抗体筛检也可能为阴性。由于每种方法都有其各自的优点和不足,不同的实验室应从自己的实际情况出发,选择适合自己实验室的方法,以保证临床输血的安全,并可为临床诊断和治疗提供有意义的依据。我站常规用血、备血用微柱凝胶免疫法,而急诊用血比较急,用凝聚胺法作为补充能比较快速的筛选不规则抗体。

[1] 王培华.输血技术学[M].北京:人民卫生出版社,1998:149-150.

[2] 李勇,杨贵贞.人类红细胞血型学实用理论与实验技术[M].北京:中国科学技术出版社,1999:251-276.

[3] 王翠平,彭道波,赵晖,等.微柱凝胶法与凝聚胺法抗体筛选检测比较分析[J].临床检验杂志,2001,19(6):355.

[4] 李沙,郑山根,欧阳锡林,等.柱凝聚技术筛检不规则抗体的初步观察[J].中国输血杂志,1999,12(3):168-169.

[5] Oytip,Nathalany.Ampaiwan Chuansumrit,Wichai Praywnwiwat,etal.Comparison between the conventional tube technique and the gel technique in direct antiglobulin test[J].Vox Sang,1997,72:169-171.

[6] Kristin Dittmar,Jo L.Proter,Kareen Cipolone,et al.Comparison of DATS using traditional tube agglutination to gel column and affinity column procebures[J].Transfusion,2001,41:1258-1262.