17－丙烯胺基－17－去甲氧基格尔德霉素对鼻咽癌细胞VEGF和Survivin表达的影响

刘 涛

（延安大学附属医院耳鼻咽喉科陕西延安716000）

17－丙烯胺基－17－去甲氧基格尔德霉素对鼻咽癌细胞VEGF和Survivin表达的影响

刘 涛

（延安大学附属医院耳鼻咽喉科陕西延安716000）

目的探讨17－丙烯胺基－17－去甲氧基格尔德霉素（17－AAG）对人鼻咽癌细胞（HNE1）的影响。方法采用流式细胞技术检测不同浓度（17－AAG）、不同时间处理后HNE1细胞凋亡情况，组织免疫细胞技术检测药物处理后对VEGF、Survivin蛋白表达的影响。结果17－AAG可以诱导人鼻咽癌细胞的凋亡，且这种作用具有时间和计量依赖性，且可抑制细胞中VEGF、Survivin蛋白的表达。结论热休克蛋白抑制剂17－AAG具有诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用，对鼻咽癌的临床治疗具有一定的指导意义。

17－丙烯胺基－17－去甲氧基格尔德霉素（17－AAG）；鼻咽癌细胞；VEGF；Survivin

热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）是在热诱导下合成的具有高度保守性质的一组蛋白质，其中HSP90β是热休克蛋白家族中的重要成员，具有重要的生理功能［1］。研究表明HSP90β作为抗原肽的载体参与了MHCI类抗原的递呈，在肿瘤免疫中具有重要作用［2］，且与肿瘤的分化程度有关，已成为抗肿瘤治疗研究的靶点。我们前期的研究发现鼻咽癌组织中HSP90β阳性率高于鼻咽部正常组织，而且其表达强度与肿瘤分化程度相关，分化程度越低，HSP90β表达越强；HSP90β阴性表达者其5年生存率明显高于阳性者。目前对于热休克蛋白抑制剂在抗肿瘤研究方面已有不少的报道［3－4］，17－丙烯胺基－17－去甲氧基格尔德霉素（17－allylamino－17－demethoxygeldanamyein，17－AAG）是目前进入临床前研究的热休克蛋白抑制剂，具有较好的应用前景，本研究探讨其对人鼻咽癌细胞株影响，以探讨17－AAG在鼻咽癌治疗中的应用。

1 材料和方法

1.1 材料

鼻咽癌细胞株（HNE1）由四川大学生物治疗国家重点实验室馈赠，延安大学医学实验中心保存，17－丙烯胺基－17－去甲氧基格尔德霉素（17－AAG）购自Sigma公司，细胞用DMEM培养基、胎牛血清（FCS）及细胞消化液胰酶（Tyrisin）购自美国Gibco BRL公司，Annexin－FITC／PI凋亡试剂盒购自北京三博公司，VEGF、Survivin单克隆抗体购自碧云天生物技术公司，凋亡检测用流式细胞仪使用美国BD公司仪器，荧光倒置显微镜及倒置显微镜均使用日本OLYMPUS公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏培养 从液氮中取出冻存保种的人鼻咽癌细胞株HNE1，迅速置于37℃水浴融化，用培养基洗涤1次。细胞培养于含10%FCS，100 ug／ml青霉素，100 ug／m l链霉素DMEM培养基中，于37℃，5%CO2饱和湿度无菌条件下常规培养，每隔2～3 d更换培养基1次。

1.2.2 Annexin－FITC／PI双染法检测细胞凋亡率的变化取处于对数生长期的HNE1细胞，以1×106个／孔接种于6孔培养板。待细胞贴壁良好后，弃去原细胞培养液，加入17－AAG使药物终浓度分别为100 nM、500 nM、1000 nM，并设立空白对照组（0 nM）。继续培养24、48、72 h后，收集细胞，500～1000 r／min离心5 min，弃上清，PBS洗2次。加入500 ul缓冲液重悬细胞，分别加入Annexin－FITC和PI溶液各5 u1、充分混匀、避光室温孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。

1.2.3 免疫组织化学法检测17－AAG对HNE1细胞survivin和VEGF蛋白表达的影响 将已处理好的盖玻片放入6孔板内，以1×105／m l细胞的密度接种2 ml于6孔培养板中，24 h后用上述方法处理细胞，继续培养48 h，处理后500～1000 r／min离心5 min，弃去上清，2 m l PBS洗2次，4%多聚甲醛固定20 min。按照试剂盒说明SP法进行免疫细胞化学染色，DNB显色，苏木素复染细胞核。光镜下阳性细胞细胞膜和细胞质可见棕黄色颗粒，核为紫蓝色。结果判断：随机取10个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞所占比率，阳性细胞比率＝（阳性细胞数／1000）x100%。

2 结果

2.1 流式细胞术检测HNE1细胞的凋亡率的变化

Annexin－FITC／PI双染法检测结果显示，17AAG处理后48 h，各组细胞的凋亡率分别为，48h对照组凋亡率为1.2%，100、500、1000 nM浓度药物组26.4%、40.2%、52.8%；72 h对照组凋亡率为0.5%，100、500、1000 nM浓度药物组分别为13.5%、19.8%、24.3%，各组与对照组比较差异有统计学意义（见图1），表明17－AAG具有诱导HNE细胞凋亡作用。

图1 1000 nM17AAG处理不同时间对鼻咽癌细胞HNE凋亡率的影响

2.2 17－AAG对HNE1细胞survivin和VEGF蛋白表达的影响

不同浓度17－AAG处理细胞24 h后，细胞免疫化学结果显示HNE1细胞胞质和胞膜内侧均表达Survivin和VEGF蛋白，呈棕黄色。对照组细胞胞质和包膜可见大量棕黄色颗粒，表明Survivin和VEGF蛋白在HNE1细胞中呈强阳性表达。药物处理组与对照组比较棕黄色颗粒明显减少，0、100、500、1000 nM等不同浓度处理组中Survivin和VEGF蛋白阳性表达阳性率经统计学分析P＜0.05，差异有统计学意义（见表1），表明17－AAG抑制了HNE1细胞中Survivin和VEGF蛋白的，且呈剂量依赖性。

表2 HNE1细胞中survivin和VEGF表达率（%）变化（均数±标准差）

3 讨论

HSP90是一类普遍存在于各种细胞的分子伴侣蛋白，通过调节多种癌蛋白的功能，参与肿瘤细胞的增殖、生存、侵袭、转移和血管生成等多种重要过程的调节。HSP家族种类较多，其中HSP90可通过不同作用机制控制细胞凋亡，被认为是抗凋亡伴侣分子。HER－2／neu、血管内皮生长因子受体（EGFR）、亚稳信号蛋白（Akt、Raf及KK）等［5］被认为是HSP90的客户蛋白，其中多数在肿瘤生长和转移的信号通路中起着重要作用，是临床确证的抗肿瘤靶点。通过抑制HSP90达到降解客户蛋白、诱导肿瘤细胞凋亡、干扰细胞周期、抑制肿瘤侵袭、转移及新生血管生成的效果，从而从多方面抑制肿瘤细胞的生长。

17－烯丙胺基－17－脱甲氧基格尔德霉素（17－AAG）是格尔德霉素的衍生物，可促进恶性肿瘤增殖和存活的多种相关蛋白分解，是第一个进入临床I期试验的HSP90抑制剂，现在已经进入Ⅲ期临床实验。I期临床结果表明病人对其具有良好的耐受性，对化疗药物耐药的部分患者使用17－AAG仍可以获得良好的效果［6］。近几年的研究表明17－AAG具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用［7］。本实验通过流式细胞仪检测凋亡结果亦显示17－AAG具有诱导HNE1细胞凋亡作用，并初步探讨了其诱导HNE1细胞凋亡的机制，用免疫组化方法检测了药物处理组Survivin及VEGF蛋白的变化，结果显示处理组细胞中Survivin和VEGF蛋白表达较对照组明显减少，且与药物剂量有相关性，与文献报道一致［8－9］。本研究对后续的动物实验及临床研究具有一定的指导意义，为鼻咽癌的治疗提供了新的方法和思路。

［1］Jerome V，Vourc＇H C，Baulien EE，etal.Cell cycle regulation of the chicken HSP90 expression［J］.Exp CellRes，1993，205（1）：44－45.

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Effects of 17－allylam ino－17－demethoxygeldanam ycin on the expression of VEGF and Survivin proteins in human nasopharyngeal carcinoma cells

LIU Tao

（Department of otorhinolaryngology，the first Affiliated Hospital of Yanan Unversity，Yanan 716000，China）

ObjectiveTo explore the effects of 17－allylamino－17－demethoxygeldanamycin（17－AAG）on human nasopharyngeal carcinoma HNE1 cells.MethodsFlow cytometry was used to detect apoptosis of HNE1 cells treated with 17－AAG with different concentration and at different time.Immunohistology was used to detect the expression of VEGF and Survivin proteins after drug treatment.Results17－AAG induced apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma HNE1 cells，which was doze and time dependent.17－AAG also inhibited he expression of VEGF and Survivin proteins.Conclusion17－AAG could induce human nasopharyngeal carcinoma cells to undergo apoptosis and may be of significance as an anti－cancer drug to treat nasopharyngeal carcinoma.

17－allylamino－17－demethoxygeldanamycin（17－AAG）；Human nasopharyngeal carcinoma HNE1 Gells；VEGF；Survivin.

R739.6

A

1672－2639（2011）01－0001－02

2010－12－20；责任编辑 赵菊梅］

项目资助：2007年延安市科学技术项目