Survivin与Smac在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其相关性研究

黄晓春 代维栋

（西安市第四医院妇产科，陕西西安710004）

Survivin与Smac在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其相关性研究

黄晓春 代维栋

（西安市第四医院妇产科，陕西西安710004）

目的探讨凋亡抑制因子Survivin及凋亡促进因子Smac在卵巢上皮性肿瘤中的表达及临床意义，并分析二者的相关性。方法RT－PCR法检测20例上皮性卵巢癌及20例良性卵巢上皮性肿瘤组织中Survivin及Smac基因的表达情况；免疫组化S－P法检测60例上皮性卵巢癌及60例良性卵巢上皮性肿瘤组织中Survivin及Smac蛋白的表达情况，分析其与上皮性卵巢癌患者各临床病理指标的关系及两者表达的相关性。结果上皮性卵巢癌组织中Survivin基因表达水平（70.0%）明显高于良性卵巢上皮性肿瘤组织（5%），Survivin蛋白在上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率为61.7%，而在良性卵巢上皮性肿瘤组织表达率6.7%，免疫组化结果与RT－PCR结果一致；Survivin蛋白在上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率与浸润深度、分化程度及淋巴结转移均相关（P＜0.05）。RT－PCR结果显示，Smac基因在上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率为40%（8／20），明显低于良性卵巢上皮性肿瘤组织90%（18／20），此结果得到免疫组化的证实，Smac蛋白在上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率为41.7%，明显低于良性卵巢上皮性肿瘤组织93.3%，而且Smac蛋白在上皮性卵巢癌中的阳性表达率与组织分化程度、浸润深度及淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。Survivin蛋白与Smac在上皮性卵巢癌癌组织中的表达呈明显负相关（P＜0.05）。结论抗凋亡蛋白Survivin和促凋亡蛋白Smac之间存在着相互拮抗，相互调节的关系，在卵巢上皮性肿瘤的发生发展中共同发挥作用。

Survivin；Smac；卵巢上皮性肿瘤；RT－PCR；免疫组化

卵巢癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，在我国发病率有逐年增高、发病年龄呈年轻化的趋势，其死亡率已高居妇科恶性肿瘤第一位，其中以上皮性癌最多见。研究表明，Survivin和Smac与多种恶性肿瘤的发生、发展关系密切，但在卵巢肿瘤中的相关报道甚少。因此，本研究采用RT－PCR和免疫组织化学的方法检测上皮性卵巢癌及良性卵巢上皮性肿瘤组织中Survivin和其拮抗因子Smac的基因及蛋白的表达，探讨二者在上皮性卵巢癌发生、发展过程中的作用，并分析二者的相关性；为进一步阐明上皮性卵巢癌的发病机制、改善上皮性卵巢癌患者预后提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集来自西安第四人民医院病理科2006－04～2009－10诊断为上皮性卵巢癌手术存档标本40例及相应的良性卵巢上皮性肿瘤组织存档标本40例。另收集西安第四人民医院2008－04～2009－10上皮性卵巢癌及良性卵巢上皮性肿瘤手术切除标本各20例。标本离体0.5～1 h内，冰上分离良性卵巢上皮性肿瘤组织及癌组织各两份，一份放于冻存管中置于－8.0℃冰箱中备用，另一份应用体积分数4%的多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，连续切片，切片厚度3～5μm，分别用于HE和免疫组织化学染色。经病理组织学证实60例癌组织均为上皮性卵巢癌，术前均未接受化疗、放疗及其他治疗，并排除其他内分泌疾病。患者年龄25～71岁。良性上皮性肿瘤60例；原发性卵巢上皮性癌60例；浆液性腺癌44例，粘液性腺癌16例。临床分期（按FIGO，2000年标准）：I～II期23例，III～IV期37例。组织学分级（按WHO标准）：分化Ⅰ级11例，分化Ⅱ级23例，分化Ⅲ级26例。淋巴结转移22例，无淋巴结转移38例。

1.2 主要试剂

TRIzol试剂购自Invitrogen公司，cDNA第一链合成试剂盒和PCR试剂盒均购自上海生工公司，Survivin和Smac兔抗人多克隆抗体、免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 半定量RT－PCR

用PR IMER 5.0软件设计Survivin、Smac和β－actin的特异引物（表1）。引物由上海生工合成。用TRIzol试剂从上皮性卵巢癌和良性卵巢上皮性肿瘤组织标本中提取总RNA，通过逆转录反应得到模版cDNA，PCR扩增体系为20μL，扩增条件为：95℃、180s；95℃40 s，58℃30 s，72℃40 s，30个循环，72℃延伸7 min。使用SYNGENE凝胶分析系统软件扫描各条带灰度值，分析两基因在组织中的相应表达水平。实验重复6次。

表1 Survivin、Smac和β－actin的特异引物序列

1.4 免疫组织化学法

免疫组化染色按照S－P试剂石蜡切片常规脱蜡脱水，3%的H2O2阻断内源性过氧化物酶15 min，微波抗原修复，小牛血清封闭10 min，加一抗孵育过夜（4℃），二抗孵育20 min（37℃），链亲合素－过氧化物酶溶液温育20 min（37℃），DAB显色15min，苏木精复染、脱水、透明、封片。三者都以PBS代替一抗作为阴性对照。阳性结果判定：Survivin和Smac阳性表达呈棕黄色颗粒，位于癌细胞浆内。按照阳性细胞比例，判定标准为：（－），0～5%；（＋），6%～25%；（＋＋），26%～50%；（＋＋＋），51%～75%；（＋＋＋＋），＞76%。

1.5 统计学方法

应用SPSS 13.0版统计分析软件进行数据分析，各组临床病理因素间关系及相关性分析均采用χ2检验。α＝0.05，P＜0.05认为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 上皮性卵巢癌癌组织及良性卵巢上皮性肿瘤组织中Survivin和SmacmRNA的表达

20例上皮性卵巢癌组织中有14例表达Survivin mRNA，而在良性卵巢上皮性肿瘤组织中1例表达；20例上皮性卵巢癌组织中有8例表达Smac mRNA，而20例良性卵巢上皮性肿瘤组织中有18例Smac mRNA表达（表2）。

2.2 上皮性卵巢癌组织及良性卵巢上皮性肿瘤组织中免疫组织化学法Survivin蛋白和Smac蛋白的表达

60例上皮性卵巢癌组织中Survivin和Smac蛋白表达阳性率分别为61.7%和41.7%。良性卵巢上皮性肿瘤组织中Survivin和Smac蛋白表达阳性率分别为6.7%和93.3%。上皮性卵巢癌组织和良性卵巢上皮性肿瘤组织间Survivin和Smac蛋白阳性表达率比较差异具有统计学意义（P＜0.01）（表3）。

2.3 Survivin蛋白和Smac蛋白的表达与上皮性卵巢癌临床病理学特征的关系

Survivin和Smac的表达均与肿瘤的良恶性、临床分期、组织学分级、淋巴结转移有关（P＜0.05），与组织学类型无关（P＞0.05）。

表2 Survivin和SmacmRNA在上皮性卵巢癌和良性卵巢上皮性肿瘤组织中的半定量表达

表3 Survivin蛋白和Smac蛋白在良性卵巢上皮性肿瘤组织和上皮性卵巢癌组织中的表达

表4 上皮性卵巢肿瘤组织中Survivin蛋白Smac蛋白的表达与临床病理学特征的关系

2.4 Survivin蛋白和Smac蛋白表达的相关性

在37例Survivin蛋白阳性表达组中，Smac蛋白阳性表达仅10例，在上皮性卵巢癌组织中Survivin蛋白的表达和Smac蛋白的表达呈明显负相关（P＝－0.363，P＜0.01）（表5）。

表5 Survivin蛋白和Smac在上皮性卵巢癌组织组织中表达的关系

3 讨论

卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，近年来其发病率显著增加，且发病的年龄范围增大。因此，探讨上皮性卵巢癌的发生及演进机制，对于降低其发生率及寻找新的防治途径都是非常重要的。目前研究表明，多种凋亡相关基因参与上皮性卵巢癌的发生、发展，细胞凋亡是一种由基因控制的自主性有序死亡，对保持组织的健康和正常生长有重要意义［1］。

Survivin是近年来发现的一种凋亡抑制基因，是凋亡抑制（inhibitor of apoptosis，IAPs）基因家族重要的成员之一［2］。第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活剂Smac，其主要作用就是去除IAPs对Caspase的抑制作用，从而促进细胞凋亡［3］。最近的研究表明Survivin和Smac之间存在着复杂的相互关系［4］。Survivin蛋白是目前发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中最小的成员。它主要表达于胚胎和发育的胎儿组织，在正常成人终末组织中不表达，但在多数肿瘤组织内则有表达［5］。研究表明，Survivin在细胞周期中具有抑制细胞凋亡和调节细胞增殖的双重作用，抗凋亡是其主要的生物学功能。Survivin可通过与下游凋亡执行者Caspase23和Caspase27结合对其活性产生直接抑制效应，阻断细胞的凋亡过程；还可抑制由细胞色素C或Caspase28诱导的caspase活化，间接阻止Caspase23和Caspase27的活性［6］；另外，Survivin通过与纺锤体的微管蛋白特异地结合，间接抑制caspase对纺锤体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞器的完整性，抑制细胞凋亡。因此认为，Survivin在恶性肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用。本研究结果显示，卵巢上皮性癌中Survivin的阳性表达率为61.7%，显著高于良性组的6.7%（P＜0.05），与Takai等［7］用免疫组化法及张淑兰等的研究结果一致［8］，可作为上皮性卵巢癌的一个早期诊断指标。60例卵巢上皮性癌病例里，淋巴结有转移者中Survivin的阳性表达率86.4%，淋巴结无转移者为44.7%（P＜0.05）。另外发现，随着癌组织临床分期的增高、组织学分化程度的降低，Survivin的阳性率逐渐增高。所以，Survivin的基因表达程度与肿瘤的发生进展和恶性程度相关，可作为卵巢癌诊断及判断预后的指标之一。

Smac蛋白是一种促凋亡蛋白，又称为DIABLO蛋白，主要分布在细胞线粒体中，是线粒体内除细胞色素C外激活Caspase的第二个因子，相对分子质量约26000［9］。Smac在不同正常组织和肿瘤组织中表达各异。Yoo等［10］研究发现约62%的癌组织中可见Smac表达，约22%的肉瘤组织中可见Smac表达，且在不同的癌和肉瘤组织中，Smac的表达有差异。Mizutani等［11］证实Smac在肝癌中的表达下降，转染Smac cDNA可以增强顺铂介导的细胞毒作用。本研究结果显示，在良性卵巢上皮性肿瘤组织中Smac蛋白的表达明显高于上皮性卵巢癌组织，且Smac表达与癌细胞的分化程度、浸润深度和有否淋巴结转移密切相关，进一步阐明在上皮性卵巢癌组织发生、演进过程中细胞凋亡处于抑制状态，从而有利于癌细胞的发展。

Survivin蛋白表达增高和Smac蛋白表达降低在抑制癌细胞凋亡过程中均有作用。上皮性卵巢癌组织中Survivin蛋白的表达和Smac蛋白的表达呈明显负相关，两者之间存在着相互拮抗，相互调节的关系，在上皮性卵巢癌癌细胞凋亡过程中共同发挥作用。

综上所述，在上皮性卵巢肿瘤中对Survivin和Smac蛋白的表达进行联合检测，不仅有助于阐明上皮性卵巢肿瘤的发生、发展，而且对预防、治疗上皮性卵巢肿瘤也有重要价值。

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The Expressions of Survivin and Smac in Epithelial Ovarian Tumor and Its Correlation

HUANG Xiao－chun，DAIWei－dong

（Department of Gynaecology And Obstetrics，Xi‘an NO.4 Hospital，Shaan Xi710004，China）

ObjectiveTo detect the expressions of Survivin and SmacmRNA and protein in epithelial ovarian tumor tissues，to investigate the clinical significance and analyze their correlation.MethodsThe Survivin and SmacmRNA expression levels from 20 cases of epithelial ovarian cancer and 20 cases ofbenign epithelial ovarian tumorswere quantified by semi－quantitiative RT－PCR，and immunohistochemical staining（S－Pmethod）was used to detect Survivin and Smac protein expressions in 60 caseswith epithelial ovarian cancer and 60 caseswith benign epithelial ovarian tumor.The relationship between Survivin and Smac protein expression was explored，and their relationship with relevant clinical pathologic characteristicswere studied.ResultsThe up－regulation of Survivin genewas observed in 70.0%（14／20）epithelialovarian cancer tissues in comparison with the paired benign epithelial ovarian tumor tissues.Positive staining rate for Survivin was61.67%in epithelial ovarian cancer tissues，while 6.7%positive staining in benign epithelial ovarian tumor tissueswas（P＜0.05），and the expression of Survivin in epithelial ovarian cancer tissues was positively correlated with invasion depth，lymph nodemetastasis and differentiation（P＜0.05）.Down－regulation of Smac genewas quantified in epithelial ovarian cancer tissues（40%）in comparison with the paired benign epithelial ovarian tumor tissues（90%）.Positive staining rate for Smac was only 41.7%in epithelial ovarian cancer tissues，while93.3%in benign epithelialovarian tumor tissues（P＜0.05）.The expression level of Smac was related to invasion depth，lymph nodemetastasis and differentiation（P＜0.05）.Negative relationship was found between Survivin and Smac in epithelial ovarian cancer tissues（P＜0.05）.ConclusionThe expression of anti－apoptosis protein Survivin was significantly correlated with pro－apoptosis protein Smac，and both of them might play an important role in the occurrence and development of epithelial ovarian tumor.

Survivin；Smac；Epithelial Ovarian Tumor；RT－PCR；Immunohistochemical S－P technique

R737.31

A

1672－2639（2011）01－0003－04

2010－12－27；责任编辑 赵菊梅］