蛋白质组学在骨疾病及成骨细胞分化中的应用*

李 颖 刘洪臣

1.蛋白质组学的概念及其研究方法

1.1 蛋白质组学的概念 蛋白质组概念最早于1994年由澳大利亚的科学家Wilkins等[1]提出，蛋白质组学主要是系统性研究一种基因组、一种生物或者一种细胞(组织)所表达的全部蛋白质。蛋白质组是一个动态的概念,在同一个机体的不同组织和细胞中不相同,在同一机体的不同发育阶段,不同的生理状态下,乃至不同的外界环境下也不相同。各种复杂的生命活动,都是特定蛋白质群体在不同时间和空间不同组合的结果。如今，蛋白质组学已经发展了近20年，已经广泛地应用于分析翻译后水平的蛋白表达。在细胞生物化学反应过程中，细胞的蛋白质组和基因组是不断改变的。蛋白多样性的大幅度上升可能主要归因于选择性剪接[2,3]和蛋白的翻译后修饰[4,5]。蛋白多样性不能完全地被单纯基因表达分析所描述，蛋白质组学为发现感兴趣的细胞和组织的生物标记提供了一种有前景的工具。

1.2 蛋白质组学的核心技术

1.2.1 双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE) 2-DE是根据蛋白质的等电点不同将蛋白质彼此分离,然后再根据蛋白质的分子量不同将其在垂直方向进一步分离。这样蛋白质与蛋白质之间能彼此较好地分离,然后采用计算机作基础的数据处理,对电泳图谱进行斑点检测、背景消减和数据构建等分析。

1.2.2 质谱分析(Mass Spectrographic analysis,MS) 质谱技术是将样品分子离子化后根据离子间的质核比和基质的差异来分析并确定分子量的方法。应用质谱技术鉴定2-DE分离的蛋白质。近年来新发展的基质辅助激光解吸离子电离(MALDI)和电喷雾电离(Electrospray，ES)使质谱不仅能分析小分子物质，也可研究生物大分子,如蛋白质和肽等[6,7]。每种蛋白基于碱基序列都会有一个特异的肽质量指纹(PMF)，这样，通过质谱仪检测出的肽质量就可以从蛋白数据库中鉴定出特异的蛋白[8]。

1.2.3 质谱成像(Imaging Mass Spectrometry)技术 质谱成像直接利用M S对组织切片蛋白鉴定是近年来出现的新方法[9]。MALDI质谱成像技术不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，它可在正常及病变的组织切片中找到每一种蛋白质分子，并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息，而事先无需知道所检测蛋白的信息，同时可对这些蛋白质分子含量进行相对定量检测。Schwartz等[10]在神经胶质瘤的临床研究中成功应用MALDI质谱成像技术对直接病变和正常组织中蛋白表达进行分析，该方法有很高的敏感度和特异度，而且可用于预后判断。

1.3 蛋白质组学中的新技术

1.3.1 DIGE技术(Differencegelelectrophoresis，D1GE) 差异凝胶电泳，是在双向凝胶电泳的基础上又形成了一项新技术，即将样品在双向电泳之前分别用不同荧光(如Cy2，Cy3，Cy5)标记，然后将标记后的3种样品混合，同时在一块胶上进行电泳，所得到的2D胶图像可使用3种不同的激发／发射过滤器得到不同颜色荧光信号，根据这些信号的比例来判断样品之间蛋白质的差异。在2D-DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，软件会根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化都真实。

1.3.2 iTRAQ技术(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ) 相对和绝对定量同位素标记技术，是美国应用生物系统公司在2004年推出的一项新的体外同位素标记技术。iTRAQ技术使用8种不同的同位素试剂来同时标记和比较8种不同的蛋白质样品。这些试剂由3个不同的化学标签组成，标签分子分别由报道基团(reporter group)、平衡基团(balance group)和反应基团(reactive group)组成。使用该技术不仅可寻找差异表达蛋白，并分析其蛋白功能，同时可以对1个基因组表达的全部蛋白质或1个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定。该技术具有较好的定量效果、较高的重复性。由于其能够同时对多达8种样品进行标记分析，故在生命科学的各个领域得到了广泛的应用。

1.3.3 ICAT(Isotope-coded affinity tag) 同位素代码标记技术，应用一种含与蛋白质反应基团、乙烯甘油结合区和生物素标记的试剂，可专与蛋白质或肽段的L2半胱氨酸的巯基反应,所带的同位素标记为含8个氢原子的(d0)轻试剂和8个氘原子的(d8)重试剂，将一个蛋白质样品用轻试剂标记,另一个样品用重试剂标记,然后将两个样品混合,经胰蛋白酶或Lys-C水解蛋白得到肽片段。混合的样品用抗生物素蛋白亲和层析法分离。这些肽段进行进一步质谱分析。它的好处在于可以将混合样品(来自正常和病变细胞或组织等)直接测试；还可快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质、尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等。

2.蛋白质组学在骨疾病中的应用

蛋白质组学也已经应用于骨疾病的研究，寻找骨生物标记和细胞信号[11]。在骨疾病的领域，传统的2-DE和质谱分析是一种标准的方法来比较正常和疾病间蛋白表达情况，通过这种方法已经获得软骨降解、骨肿瘤、骨关节炎和股骨头坏死与正常组织间的特异的蛋白表达谱[12-19]。通过蛋白质组学研究，表1总结了应用蛋白质组学骨疾病中发现的蛋白标记。这些研究的主要目的就是为了发现疾病的特异性蛋白标记，利于机制研究。然而，这种分析会产出大量的生物学信息很难去辨别。蛋白质组学方法应用于活体实验试图揭示细胞性活动和细胞培养中的信号转导[20]，但这样的发现对于体外是否具有同样的意义还是未知的。

3.蛋白质组学在成骨细胞分化中的应用

自从认识到，由于骨形成障碍以及成骨细胞和破骨细胞活性的不平衡会导致骨疾病[21]，最近的蛋白质组学研究主要集中在这些细胞的分化和它们的功能研究上。成骨细胞来源于多向分化潜能的骨髓基质细胞(BMSC)，可以合成骨基质，而破骨细胞来源于单核细胞，可以吸收骨[22]。成骨细胞在很多代谢性疾病中都受到一定的影响，吴璇等[23]研究证实糖尿病大鼠颌骨成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)以及成骨相关基因Runx2表达异常。到目前为止，有许多研究对骨髓基质细胞的自我更新和分化，以及成骨性方面进行了蛋白质组学研究。骨髓基质细胞，也指可塑粘附细胞和集落形成成纤维细胞，具有多向分化潜能和自我更新能力[24,25]。新的分子和细胞技术用于骨髓基质细胞的定量和生物标记，包括 STRO-1、CD29、CD44、 CD90、CD105、CD166 和 MHC-1[26]。然而，这些生物标记并不特异性得表达在干细胞上，控制骨髓基质细胞自我更新的分子机制也尚不清楚。通过双向电泳进行蛋白分离，而后进行质谱分析获得在分化阶段骨髓基质干细胞克隆的蛋白质组信息。这些信息的研究表明，低扩增分化传代培养BMSC，其差异蛋白主要分以下几种功能类：代谢、信号转导、细胞粘附、细胞生长、细胞骨架、细胞间作用、细胞周期、蛋白降解和铁代谢。尤其，高扩增(少分化)与低扩增的BMSC相比，钙调蛋白、T-complex protein 1 α-亚基和原肌球蛋白上调，而钙调合素蛋白和minralocorticoid receptor下调[27，29]。认为这些蛋白与细胞周期和增殖有关[28]，对于骨代谢是也有一定作用[30]。另外一些研究，利用双向电泳和质谱分析研究MSC向成骨细胞分化，得出了标准的成骨细胞分化的蛋白信息。一些特异性的差异蛋白，比如chloride intracellular channel 1，认为它对成骨细胞分化起到了重要的作用[31,32]。

表1 应用蛋白质组学在骨疾病中发现的蛋白标记。

Spreafico做的2D-PAGE的研究，主要比较了初期培养的人成骨细胞在不同分化阶段分离，从前成骨细胞(E1细胞)到分化了的成骨细胞(E1P1细胞)蛋白质组的差异[33]。结果显示，显现出2400个差异点，这些点中，有3个仅在E1胶中有，32个点只在E1P1胶中发现。在E1P1细胞蛋白质组中总共17个蛋白上调。大多数上调的蛋白并没有被报道认为是成骨细胞分化的调节者。这些蛋白可以呗分为4个功能组：细胞结构活力，蛋白降解，能量产生和抗氧化保护。在E1P1细胞中观察到Cathepsin D显著上调，这可能与他在TGF-β以及胰岛素样生长因子-II(IGF)的细胞外加工作用有关系，这两个蛋白被认为是促进成骨有丝分裂的重要因子。E1P1细胞中另外上调的的蛋白是UCH-L1，硫氨基水解酶(thiol-hydrolase)，属于泛肽依赖蛋白水解系统，对于真核生物正常生长以及分化很重要。这项研究是第一个报道UCH-L1在成骨细胞分化过程中上调的。然而，这个在之前已有研究认为它参与了神经元细胞的分化。之前还有报道过其他一些酶是成骨细胞分化的重要因子，比如α-enolase，ATP合成酶，谷胱苷肽-S-转移酶，在E1P1细胞中同样上调。另外，Spreafico深入研究比较了SaOS-2细胞系和E1P1成骨细胞，试图鉴定与骨肉瘤肿瘤发生及进展相关的标记，这些有可能应用与肿瘤诊断和转移可能性的评估。另外，一种碱性磷酸酶的过表达，肌酸激酶亚型B，150kDa的氧调控蛋白，视网膜母细胞瘤相关蛋白4认为潜在肿瘤标记物。关于分化的成骨细胞，SaOS-2和E1前成骨细胞的Hsp27、Cathepin D、过氧化物歧化酶、谷胱苷肽脱氢酶、降钙素和烯酰辅酶A水解样蛋白都表现出明显下调。这些发现显示他们可作为成骨细胞分化标志的潜能。

最近，研究人员发现，一些激素，生长因子和酶可以调控成骨细胞的生长，成熟和活性[33]，提示这些循环因素可能通过特定的信号通路来影响成骨分化。MSC给予特定的激素或生长因子后，对其蛋白提取物进行双向电泳和质谱分析，为了获得可能在特定信号通路起重要作用的差异蛋白[34-36]。用加入EGF和PDGF培养人骨髓基质细胞，该培养基中还包含了特殊形式的精氨酸，比如常规的12C6,14N4，或是同位素变异的12C6,14N4或是13C6,15N4，代谢性标记了整个蛋白组，用同位素标记定量的质谱分析软件，使这些标记了的蛋白在进行质谱分析时可以被区分出来。定量蛋白质组学研究可以直接比较整个受EGF和PDGF调控的成骨分化的信号网络，也能发现两因素在PI3K通路中的重要的差异[37]。

Olkku研究发现地塞米松对人成骨细胞系(比如 MG-63,G-292,SaOD-2和 U2-OS)、一定条件下永生的人前成骨细胞(HOB-03-C5)以及人成熟成骨细胞(HOB-03-CE6)蛋白表达的影响[38]。研究表面在给予地塞米松治疗后，主要上调了MG-63、G-292、HOB-03-C5和HOB-03-CE6细胞中的谷氨酰胺合成酶，最先在转录和翻译水平观察到地塞米松诱导该酶的上调。当时关于谷氨酰胺合成酶在骨细胞中的作用还很鲜为人知的时候，Olkku认为在诱导谷氨酰胺合成酶和糖皮质激素诱导的凋亡间没有直接的联系。

Salasznyk用蛋白质组学比较了人成骨细胞和人骨髓基质细胞之间的蛋白表达差异[39]，这个研究集中于鉴定潜在的成骨标记，结果显示有737个不同的蛋白点。总共有257个(34%)的点在两种细胞中都表达，剩下的480个点中有312(65%)证明仅在成骨细胞中表达。这个发现表明在成熟的成骨细胞和那些未分化的骨髓基质细胞的蛋白质组有着显著差异。

有研究为了鉴定伴侣蛋白表达形式，比较了包括成骨细胞起源的骨肉瘤细胞(SaOS-2)在内的10种肿瘤细胞系[40]。在凝胶内消化后应用MALDI-MS鉴定蛋白，得到鉴定伴侣蛋白的列表，这些伴侣蛋白在不同细胞系中有不同的表达形式。有意思的是，有一个和肿瘤排斥抗原相似的蛋白仅在SaOS-2细胞中表达，而应力诱导的磷蛋白1在所有肿瘤细胞系内表达，唯独除了SaOS-2细胞。脂皮质蛋白I，一种细胞分化和凋亡的启动子，其在SaOS-2中表达的下降与肿瘤细胞的生物学特性是相一致的。脂皮质蛋白II在很多肿瘤细胞中上调,它的低表达可能是骨肉瘤细胞外基质显著性减少的特性表现。该研究表明，用人的原始细胞取代永生化的细胞系，提供了一个很好的机会将获得的成骨推向临床调查。

4.展望

综上所述,蛋白质组学技术在骨相关疾病以及成骨分化中的应用越来越广泛，研究技术不断进步并取得了一些成绩，但是该技术在这一领域的应用目前还处于比较肤浅的阶段，主要用于蛋白质组表达模式分析，真正涉及功能蛋白质组的研究还很少，与实际应用的差距则更远。我们相信，随着方法的不断改进与研究的不断深入，蛋白质组学在骨相关疾病研究领域将有十分广阔的应用前景，为骨相关疾病的临床诊断及诊治提供更可靠有效的帮助。

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