低强度超声对放射线损伤的犬下颌骨微血管修复作用的实验研究*

陈 磊 吴高义 王昭领 朱国雄

下颌骨放射性骨坏死(Osteoradionecrosis of Mandible ORNM)是头颈部恶性肿瘤放疗后严重的并发症，主要病理表现为放疗后颌面部软、硬组织处于低氧、少血管状态，颌骨内动脉发生炎症反应，内膜肿胀，骨髓及骨膜血管栓塞及纤维化，引起局部血供和营养障碍。现在观点认为ORNM是血管和Naversa骨系统放射后的晚期并发症[1]。放疗可导致组织血供变差、细胞活力下降、胶原蛋白减少。因此，如何促进放疗后骨组织内血管的修复，对于治疗ORNM具有重要意义。近年来研究发现[2]，低强度超声波可以促进血管的发生，改善局部血液循环，但运用低强度超声波治疗ORNM，尚无相关研究报道。因此，本研究通过观察低强度超声对下颌骨内微血管的作用，探讨运用低强度超声波治疗ORNM的可能机制。

1.材料与方法

1.1 材料 放射源采用Varian 600C/D电子加速器 (Varian Inc.Corporate， USA)； Leica DMLA全自动显微镜(Leica公司，德国)，US10超声治疗仪(兴万电子仪器，香港)；健康成年杂种犬30只，雌雄不限，年龄2-3周龄，体重10-17kg，(由山东大学实验动物中心提供)，普通饲料喂养(山东大学实验动物中心提供)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立 将犬随机分为实验Ⅰ组、实验Ⅱ组和对照组，每组10只。2.5%戊巴比妥钠30mg/kg犬小腿大隐静脉注射麻醉。电子直线加速器行分次次照射。照射方法：总剂量60 Gy，分4次照射，每次15Gy，每2次之间间隔一周，对照组不行放射线照射。照射结束后1个月，无菌条件下拔除实验动物双侧下颌第一磨牙。继续饲养动物。

1.2.2 CD34免疫荧光染色 分别在放射线照射后1个月，2个月，4个月，3%戊巴比妥钠30mg/kg行隐静脉注射麻醉，取各实验组下颌骨磨牙区骨块。4%多聚甲醛溶液固定2天，脱钙，按常规组织免疫方法制成连续石蜡切片，片厚5μm，切片经常规烤片，免疫组化SABC法抗CD34抗体(博奥森生物技术有限公司北京)免疫荧光染色，二抗用荧光素标记大鼠抗犬IgG(博奥森生物技术有限公司北京)，荧光显微镜下进行观察微血管的变化，光镜下进行观察。荧光显微镜下CD34以血管内皮细胞胞质呈棕红色为阳性表达。

1.2.3 超声治疗和微血管密度(MVD)检测 对放射线照射4个月后的实验Ⅰ组动物行超声治疗，治疗部位为双侧下颌第一磨牙区，方法为超声强度30mW/cm2，频率 1.5 MHz，脉冲宽度 200μs和重复频率1kHz的脉冲波[3]，每天使用1次，每次20min，治疗时间30d，实验Ⅱ组作为阴性对照不做超声治疗。

分别于超声治疗10d，20d，30d取材，下颌骨于20%多聚甲醛溶液固定2天。取部分脱钙，石蜡包埋，按常规组织免疫方法制成连续石蜡切片，片厚5μm，切片经常规烤片，免疫组化SABC法抗CD105(博奥森生物技术有限公司北京)抗体染色，苏木素复染，中性树胶封片，光镜下进行观察。CD105以血管内皮细胞胞质呈棕褐色为阳性表达，对免疫组化染色切片进行图像采集，切片在40倍光镜下挑选微血管分布最高区域，在200倍视野下计数5个视野的被染成棕褐色的血管数目，取其平均值作为MVD，每一个与邻近的微血管明显分离的染成棕褐色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管并进行图像分析。

1.3 统计学分析：所有数据均采取均数±标准差表示，两组间数据间比较用成组设计资料的t检验，有关指标采用SPPS13.0统计软件做相关分析。

2.结果

2.1 体表结果 在照射1周后，实验组犬均出现进食困难、流口水、口腔内粘膜溃烂等症状，1个月后，实验Ⅰ组、实验Ⅱ组犬的下颌开始脱毛，4个月后牙槽骨外露,主要位于拔牙区(图1)。X线片上显示局部骨小梁增粗，骨纹理模糊，出现不规则的结构紊乱区，且密度不均匀

2.2 CD34免疫荧光结果 对照组CD34呈红色荧光强阳性表达，实验Ⅰ组呈阳性表达；实验Ⅱ组呈弱阳性表达(图2-6)。

2.3 微血管密度(MVD)检测结果 实验Ⅰ组的微血管密度为：10d组(4.04±0.77)，20d组(6.22±0.65)，30d 组(7.13±0.43)；、实验Ⅱ组的微血管密度为(3.85±0.89)；对照组的微血管密度为(7.41±0.45)。统计结果显示各组之间的差异具有显著性的意义(P＜0.05)(表1)。

表1 各组不同时间点血管密度(n=5,)

表1 各组不同时间点血管密度(n=5,)

3.讨论

3.1 建立下了颌骨放射性损伤的动物模型 上世纪初，人们就已经认识到放射线能引起骨组织的损害，但通过动物实验来研究其损害是由Chambers等在1958年用狗开始的[4]。后来，不少学者相应采用大鼠、兔、狗等动物来做实验研究[5,6]。但由于鼠、兔类动物体积小、生命力弱等原因一直未能建立理想的动物模型。对于放疗的剂量，普遍的观点是，骨组织的放射耐受剂量为60Gy左右，当放疗超过60Gy时，骨修复损伤的能力受到较大损害。而整块骨的大部分照射剂量小于60Gy时，骨组织尚处于其耐受剂量范围，具有一定修复能力[7]。

因此，在本实验采用的总照射剂量为60Gy。放射线照射3个月后，我们通过X线片发现犬的下颌骨均出现骨小梁增粗，骨纹理模糊等ORNM的早期症状。在对血管内皮标记抗体CD34的检测后发现，随着时间的延长，犬下颌骨的CD34抗体阳性表达越来越弱，表明骨损伤的程度越来越严重，这也很好的模拟ORNM发生过程。说明直线加速器行多次照射总剂量60Gy完全可以作为犬ORNM模型的照射剂量。虽然更大的照射剂量虽然也可能发生ORNM，但有可能会引起动物死亡，影响实验的继续进行。且60Gy已经能够较好模拟人的放疗剂量。因此，我们认为，本实验所采用的多次照射总剂量60Gy为犬ORNM动物模型较为理想的照射剂量。

3.2 低强度超声能够促进犬下颌骨微血管的生成 目前的血管内皮标记抗体主要有：CD34，CD31，CD105(endoglin)等，有人认为CD34在微血管中表达最强，也有人认为CD31对微血管内皮细胞敏感性较强。但CD105(endoglin)对增殖状态的血管内皮细胞有高度敏感性是大家所公认的[8,9]，而其对于成熟的血管内皮细胞却无特异性，因而在目前还缺乏直接检测血管丰富程度的情况下，可用CD105标记血管内皮细胞，检测骨内血管的增值程度已成为对血管生成定量分析的金指标。本实验实验结果表明，采用30mW/cm2强度的1MHz 1∶4脉冲超声波作为实验组处理因素，超声治疗10d，20d，30 d，MVD逐渐增加，说明低强度超声能够促进了骨组织的微血管生成，并可能以此促进犬下颌骨血供。

3.3 低强度超声促进犬下颌骨微血管修复的机理 高能射线粒子对血管、骨等组织损伤，是通过细胞内水分子转变为自由基，如H+、OH+；与DNA、RNA或酶分子作用，破坏分解氨基酸或核酸序列。在细胞水平上，表现为染色体断裂、交联和分解，使细胞损伤或死亡。在组织水平上，则表现为血栓形成[10]，内皮坏死和玻璃样变性。因此，修复放射线损伤骨组织，促进血液循环非常重要。

低强度超声可以穿透组织，其产生的振荡力作用于组织中包括细胞内和细胞外的各种液体及胞膜成分。振荡的生理效应可以分为致热效应和非致热效应。致热效应能增加血运，增加胶原延展性，减轻疼痛和肌肉痉挛[11]，超声还能使无功能性毛细血供，从而使各类细胞因子及促进骨愈合的必要成分的运输增强，促进了营养物质转运和代谢废物排除[12]。

低强度超声可以增加肥大细胞脱颗粒，增加白细胞对血管内皮细胞的粘附，刺激成纤维细胞产生胶原，增加吞噬性成纤维细胞和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)的释放，实验表明超声可以刺激人下颌骨细胞、牙龈成纤维细胞和外周血单核细胞产生多种促进血管发生的细胞因子，包括IL-8、bFGF和VEGF等[13]。进而促进新生血管形成[14]，增加血流。超声可以诱导骨髓基质细胞表面粘附分子的表达(P-selectin and ICAM-1)，使移植入肌肉内的骨髓基质细胞诱导周围血管发生[15]。

4.小结

低强度超声对放射线损伤的下颌骨微血管修复作用更主要是通过促进血管发生来间接促进骨的愈合。超声促进创伤、慢性溃疡愈合，促进骨折等作用都与其增强血管生成的作用密切相关。最佳时机多在固定期早期。但究竟低强度超声具体作用的靶细胞是什么，其作用的详细机制以及信号传导途径还有待进一步阐明。

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