三氧化二砷对rIL-13诱导肺成纤维细胞增殖和炎性介质表达的影响

肖 莉，李凤春，李振华

(1中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004;2中国医科大学附属第一医院)

目前研究认为，三氧化二砷(As2O3)除能诱导急性早幼粒白血病细胞凋亡外［1］，亦能抑制多种细胞增殖并促进其凋亡［2］。目前肺纤维化治疗较为棘手，而IL-13为调控其病理过程的主要Th2细胞因子，其抑制剂能减轻Th2主导炎症反应所致肺组织纤维化程度［3］。2006年12月，我们观察了As2O3对IL-13促肺成纤维细胞增殖及炎性介质分泌的影响，旨在进一步研究As2O3的抗肺纤维化机制。

1 材料与方法

1.1 材料 肺 成纤维NIH3T3细胞株;0.1%As2O3注射液，重组白细胞介素(rIL)-13;四甲基偶氮唑蓝(MTT)，由PBS稀释成12 mmol/L后过滤除菌，4℃避光保存;兔抗小鼠巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α多克隆抗体及原位杂交试剂盒，IL-6、IL-8放射免疫检测试剂盒。

1.2 细胞处理及增殖抑制率(IR)检测 将NIH3T3细胞接种于含体积分数10%FBS、无抗生素的DMEM培养瓶中，置37℃、5%CO2培养箱中饱和湿度下培养。将传代至对数生长期且0.2%台盼蓝拒染率＞95%的细胞随机分为观察1组、观察2组及对照组，调整细胞数为2×105/ml，按每孔200 μl加入96孔板中，37℃、5%CO2培养24 h后弃去培养基，观察1组、观察2组均加入80 ng/ml rIL-13，此外观察1组及观察2组分别加入2、4 μmol/L的As2O3溶液各200 μl，对照组加入DMEM，三组均培养24 h和48 h。三组每孔中加入MTT 15 μl，继续培养3 h，加入二甲基亚砜(DMSO)100 μl，于490 nm处测定吸光度值(每组均重复作5孔)。IR(%)=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%。

1.3 细胞处理及 MIP-1α mRNA表达测定 取NIH3T3细胞以2×105/ml种植于培养瓶和内装有盖玻片的6孔板中，24 h细胞贴壁后弃去培养液同上分组及处理，同时设仅加入rIL-13者为观察3组，各组均培养24 h(每时间点设6个复孔)。采用原位杂交法测定MIP-1α mRNA表达:将培养于盖玻片的各组细胞用4%多聚甲醛室温固定20min，加胃蛋白酶于37℃消化60 s，37℃加预杂交液4 h，37℃杂交过夜;洗片，封闭液37℃封闭30min，分别滴加生物素化鼠抗地高辛、链霉亲和素—生物素—酶复合物(SABC)、生物素化过氧化物酶，PBS洗涤;DAB显色，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明封片。阴性对照用预杂交液替代探针工作液。采用Metamorph/DP10/型细胞图像分析仪进行 MIP-1α mRNA半定量分析(光密度值)，其中表达阳性指细胞质内颗粒呈棕褐色点状或条状分布。

1.4 细胞IL-6、IL-8水平测定 收集1.3各组细胞培养上清，采用IL-6、IL-8放射免疫试剂盒检测IL-6、IL-8水平，具体步骤按试剂盒说明进行。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行统计学处理。计量资料以±s表示，两样本均数间比较用t检验，多个样本均数间比较用方差分析。P≤0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 IR As2O3处理后观察1组、观察2组细胞增殖明显受抑，且呈剂量和时间依赖关系(P＜0.01)，见表1。

表1 As2 O3处理后24、48 h观察1组和观察2组IR 比较(n=5，%，±s)

表1 As2 O3处理后24、48 h观察1组和观察2组IR 比较(n=5，%，±s)

注:与观察1组同时间点比较，*P＜0.01;与同组24 h比较，△P＜0.05

24 h 48 h观察1组 30.13±5.60 53.14±8.25组别△观察2组 55.14±9.03* 71.05±10.62＊△

2.2 MIP-1α mRNA表达 观察1组为15.23±3.16、观察2组为10.22±3.56、观察3组为40.15±3.66、对照组为25.83±2.35，观察3组 MIP-1α mRNA表达显著强于其他三组，且观察2组强于观察1组(P均＜0.05)。

2.3 IL-6、IL-8水平 见表2。

3 讨论

表2 各组 IL-6、IL-8 水平(n=6，±s)

表2 各组 IL-6、IL-8 水平(n=6，±s)

注:与其他三组比较，*P＜0.01;与对照组比较，△P＜0.05

组别 IL-6(pg/ml) IL-8(ng/ml)观察1组 109.22±20.14△0.26±0.08△观察2组 92.64±21.66△0.25±0.11△观察3组 548.66±71.76*0.51±0.07*对照组143.36±25.870.31±0.06

研究显示，成纤维细胞是肺纤维化发生、发展过程中真正的效应细胞［4］，其不仅可分泌胶原促进细胞外基质沉积，还可分泌炎性介质，对中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞的活化和聚集有促进作用。我们前期的研究表明，成纤维细胞表面有IL-13受体，IL-13能促进成纤维细胞增殖、分泌炎性介质和增强Ⅰ型胶原表达［5］。As2O3是传统中药砒霜的主要成分，是目前肿瘤患者化疗最有效的药物之一，其作用机制主要包括刺激分化、诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖和抑制血管生成［6］。Han 等［7］发现 As2O3对子宫颈癌Hela细胞、牛肺动脉上皮细胞、人肺成纤维细胞等亦具有上述作用;我们前期实验结果表明，As2O3可抑制NIH3T3成纤维细胞增殖，且呈时间—浓度依赖效应;As2O3可使细胞周期G0/G1期比例增加，G2/M期减少，即将细胞阻滞在G0/G1期。本研究显示，As2O3处理后观察1组、观察2组细胞增殖明显受抑，且呈剂量和时间依赖关系。进一步证实As2O3可能对肺纤维化的发展有阻滞作用，但具体机制有待于深入研究。

目前认为，肺纤维化是Th2型细胞因子调控炎症反应的结果，细胞因子平衡向Th2方向转化时即可导致肺纤维化，故细胞因子网络失衡在肺纤维化发生、发展过程中起重要作用。IL-6是Th2细胞因子，正常情况下可由淋巴类或非淋巴类(如T细胞、B细胞及成纤维细胞)分泌，具有较强的促平滑肌细胞增殖作用。IL-8是中性粒细胞趋化因子，在肺部主要由肺泡巨噬细胞分泌。研究证实，肺成纤维细胞亦能分泌IL-8［8］;特发性肺纤维化患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中中性粒细胞数量显著增高，IL-8可能通过趋化作用募集更多的中性粒细胞而发挥致肺纤维化作用，rIL-13可促进体外培养的成纤维细胞分泌IL-6和IL-8;As2O3能降低博来霉素致肺纤维化大鼠BALF中中性粒细胞百分比及肺组织羟脯氨酸含量。本研究显示，观察3组IL-6、IL-8水平显著高于其他三组。提示成纤维细胞参与了炎症反应过程，As2O3可通过调节Th1/Th2细胞因子失衡和抑制中性粒细胞聚集发挥抗肺纤维化作用。MIP-1α属C-C型趋化因子，可由巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞分泌，是引导单核细胞和淋巴细胞定向趋化的重要因子。多数肺纤维化在机体损伤后(损伤、炎症和修复)一个或更多阶段存在失衡［9］，其中MIP-1α等趋化因子在肺炎和肺纤维化过程中起重要作用。Standiford等研究表明，特发性肺纤维化患者BALF中MIP-1α水平显著高于对照组，且其BALF对单核细胞的趋化活性比对照组增高1.8倍;特发性肺纤维化患者肺组织中成纤维细胞MIP-1α表达水平显著高于对照组。本研究显示，As2O3可抑制rIL-13促成纤维细胞内MIP-1α表达的作用，且呈剂量—效应关系。表明As2O3可能通过抑制Th2细胞因子所致趋化作用而在抑制炎症反应和抑制成纤维细胞增殖等多方面发挥抗肺纤维化作用。

总之，As2O3可能通过抑制rIL-13诱导的成纤维细胞增殖及炎性介质表达而发挥抗肺纤维化作用。

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